一种茄二十八星瓢虫高致死基因及其在防治瓢虫的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种茄二十八星瓢虫高致死基因及其在防治瓢虫的应用。本发明专利技术筛选得到一种茄二十八星瓢虫基因RPL13，以该基因作为靶标基因沉默其表达可对茄二十八星瓢虫产生高致死作用，因此开发了能够高效防治茄二十八星瓢虫的技术，即直接饲喂对茄二十八星瓢虫具有高致死能力的靶标基因dsRNA，利用靶标基因dsRNA对茄二十八星瓢虫的致死效应达到防治目的。该方法操作方便、有效性和灵敏性好、杀虫效率高，且具有环境友好等诸多优点，有很好的应用前景。

A high lethal gene of 28 star Ladybug and its application in the control of ladybug

The invention discloses a high lethal gene of Solanaceae 28 star Ladybug and its application in the prevention and control of ladybug. The rpl13 gene of 28-star-ladybug is screened out by the invention. Silencing the expression of the rpl13 gene as the target gene can produce high lethal effect on 28-star-ladybug. Therefore, the technology that can effectively prevent and control 28-star-ladybug is developed. That is to say, directly feeding the target gene dsRNA with high lethal ability to 28-star-ladybug, using the target gene dsRNA to 28-star-ladybug The lethal effect of ladybug can achieve the goal of control. This method has many advantages, such as convenient operation, good efficiency and sensitivity, high insecticidal efficiency, environmental friendliness and so on.

【技术实现步骤摘要】
一种茄二十八星瓢虫高致死基因及其在防治瓢虫的应用
本专利技术属于虫害防控
更具体地，涉及一种茄二十八星瓢虫高致死基因及其在防治瓢虫的应用。
技术介绍
茄二十八星瓢虫Henosepilachnavigintioctopunctata(Fabricius)属于鞘翅目瓢虫科，主要为害茄子、马铃薯等茄科蔬菜，寄主植物十分广泛，是一种重要的农业害虫。其幼虫和成虫均以叶片为食，喜群集于叶片背面，取食下表皮、叶肉，受害叶片通常形成不规则透明斑或穿孔，严重时造成植株萎蔫甚至整株死亡。茄二十八星瓢虫在我国的分布范围广泛，尤其是长江以南发生密度较大。近年来，由于气候变暖、贸易发展以及保护地蔬菜栽培面积的扩大，其食料一年四季不断，茄二十八星瓢虫的发生和为害愈加严重。2015年，我国启动了马铃薯主粮化战略，必将进一步扩大我国马铃薯的种植面积，茄二十八星瓢虫的防治刻不容缓。目前，茄二十八星瓢虫的防治包括人工捕捉、引诱剂诱杀、化学农药。其中人工捕捉不仅效果差，还有十分繁重的劳力问题；而引诱剂诱杀的效果也不尽如人意，不彻底；因此更多还是依赖于化学农药，但是化学农药会引起环境污染和农产品质量安全等众多问题。RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是一种在进化上保守，依赖于产生的短片段RNAs(siRNAs)，从而促进同源mRNA的降解或抑制其翻译的作用机制。RNAi提供了一个在昆虫中进行功能基因组学研究的重要工具，且为开发对环境友好的害虫治理方法奠定了基础。由于使用RNAi技术可以特异性抑制基因的表达，所以该技术已经广泛应用于靶向干扰害虫基因从而达到防治害虫的目的，但是目前国内外还没有对茄二十八星瓢虫基因功能的研究，未有杀虫活性的靶标基因报道。本专利技术人团队前期研究显示(201710949193.9)，利用直接饲喂合适的外源dsRNA的方式即可实现对瓢虫的毒性，因此从基因层面开发适用于防治茄二十八星瓢虫的外源dsRNA产品，使用方便、成本低，更由于基因的特异性，可实现精确、优异的防治效果，对环境友好，在茄二十八星瓢虫的防治方面具有很大的应用前景。然而，相关靶标基因的筛选，以及防治效果好、特异、稳定的dsRNA的设计是最大的难题和关键问题。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有茄二十八星瓢虫防治技术的缺陷和不足，提供一种茄二十八星瓢虫的高致死基因，即RPL13基因。并基于该基因开发了能够高效防治茄二十八星瓢虫的技术，即直接饲喂对茄二十八星瓢虫具有高致死能力的靶标基因dsRNA，利用dsRPL13对茄二十八星瓢虫的致死效应达到防治目的。该方法操作方便、有效性和灵敏性好、杀虫效率高，且具有环境友好等诸多优点，有很好的应用前景。本专利技术的目的是提供一种茄二十八星瓢虫RPL13基因及其防治茄二十八星瓢虫的应用。本专利技术另一目的是提供一种可用于防治茄二十八星瓢虫的RPL13基因的dsRNA及其应用。本专利技术再一目的是提供一种防治茄二十八星瓢虫的方法及试剂盒。本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：本专利技术基于茄二十八星瓢虫的转录组文库，筛选得到一个高致死基因——RPL13基因，并开发了饲喂RPL13基因的dsRNA(dsRPL13)防治茄二十八星瓢虫的技术。本专利技术把茄子叶片分别浸泡在试剂盒合成的dsRPL13和dsGFP的溶液中，取出晾干后饲喂茄二十八星瓢虫的1龄幼虫2天，而后以未用dsRNA处理的茄子叶片饲喂，观察记录茄二十八星瓢虫的死亡率和发育状态；另外，用菌液表达dsRPL13的方法测定了其对茄二十八星瓢虫1龄、3龄以及成虫的致死能力，进而全面的评价外源dsRPL13对茄二十八星瓢虫的杀虫活性。最后，利用荧光定量PCR(qPCR)的方法检测分析了RPL13基因在取食了dsRPL13和dsGFP茄二十八星瓢虫中的表达量变化。结果显示，直接饲喂外源dsRPL13可显著抑制茄二十八星瓢虫RPL13基因表达，直接饲喂外源dsRPL13对茄二十八星瓢虫具有很高的致死效应。因此，以下主题及应用均应在本专利技术保护范围之内：一种茄二十八星瓢虫RPL13基因，其序列如SEQIDNO.1所示。所述RPL13基因的沉默靶标片段，其序列如SEQIDNO.2所示。所述RPL13基因或其沉默靶标片段在防治茄二十八星瓢虫或制备防治茄二十八星瓢虫的产品中的应用。所述RPL13基因或其沉默靶标片段在抑制茄二十八星瓢虫生长或制备抑制茄二十八星瓢虫生长的产品中的应用。所述RPL13基因或其沉默靶标片段在促进茄二十八星瓢虫死亡或制备促进茄二十八星瓢虫死亡的产品中的应用。所述RPL13基因或其沉默靶标片段的抑制剂在防治茄二十八星瓢虫或制备防治茄二十八星瓢虫的产品中的应用。一种可用于防治茄二十八星瓢虫的dsRNA，该dsRNA沉默靶基因为上述RPL13基因。优选地，dsRNA序列如SEQIDNO.2所示。一种防治茄二十八星瓢虫的试剂盒，含有RPL13基因抑制剂。优选地，所述抑制剂为上述dsRNA。具体地，利用RPL13基因防治茄二十八星瓢虫的途径之一，即一种防治茄二十八星瓢虫的方法，直接饲喂外源dsRNA，使得dsRPL13进入茄二十八星瓢虫体内，该dsRNA可沉默/抑制茄二十八星瓢虫的RPL13基因表达，抑制茄二十八星瓢虫生长、促进茄二十八星瓢虫死亡，从而达到防治茄二十八星瓢虫的目的。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术筛选得到一种茄二十八星瓢虫的高致死基因RPL13基因，并开发了其高效沉默dsRNA，开发了能够高效防治茄二十八星瓢虫的技术，即直接饲喂对茄二十八星瓢虫具有高致死能力的靶标基因dsRNA，利用dsRPL13对茄二十八星瓢虫的致死效应达到防治目的。该方法操作方便、有效性和灵敏性好、杀虫效率高，且具有环境友好等诸多优点，有很好的应用前景。附图说明图1为试剂盒合成的dsGFP和dsRPL13电泳图。图2为菌液表达的dsGFP和dsRPL13电泳图。图3为取食dsGFP和dsRPL13后茄二十八星瓢虫存活率的变化；利用实验开始后10天的幼虫死亡率数据，用Cox回归程序建立存活曲线。不同字母(如a、b)表示对照曲线与处理曲线有显著性差异。图4为取食dsGFP和dsRPL13后茄二十八星瓢虫幼虫表型的变化；从饲喂dsRNA开始的第3天，正常发育的dsGFP对照组(A)和死亡的dsRPL13处理组(B)茄二十八星瓢虫表型差异。图5为取食dsGFP和dsRPL13对茄二十八星瓢虫生长发育的影响。图6为取食菌液表达的dsRPL13对茄二十八星瓢虫存活率的影响(图A：1龄幼虫的存活率；图B：3龄幼虫的存活率；图C：成虫的存活率)。利用12天的幼虫死亡率数据，用Cox回归程序建立存活曲线。不同字母(如a、b)表示对照曲线与处理曲线有显著性差异。图7为取食dsRPL13后2天和4天时RPL13基因相对表达量的变化。具体实施方式以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种茄二十八星瓢虫RPL13基因，其特征在于，其序列如SEQ ID NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种茄二十八星瓢虫RPL13基因，其特征在于，其序列如SEQIDNO.1所示。


2.权利要求1所述RPL13基因的片段，其特征在于，其序列如SEQIDNO.2所示。


3.一种可用于防治茄二十八星瓢虫的dsRNA，其特征在于，所述dsRNA沉默靶基因为权利要求1所述RPL13基因。


4.权利要求1所述RPL13基因或权利要求2所述片段或权利要求3所述dsRNA在防治茄二十八星瓢虫或制备防治茄二十八星瓢虫的产品中的应用。


5.权利要求1所述RPL13基因或权利要求2所述片段或权利要求3所述dsRNA在抑制茄二十八星瓢虫生长或制备抑制茄二十八星瓢虫生长的产品中的应用。

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【专利技术属性】
技术研发人员：潘慧鹏，吕晶，郭威，杨春晓，郭木娟，陈诗敏，邱宝利，刘卓琦，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44