包含小热激蛋白的微粒制造技术

本发明专利技术涉及一种生物可降解微粒，所述生物可降解微粒直径为0.2-3.5微米且含药学有效量的诱导巨噬细胞中IL-10生成的至少一种小热激蛋白，所述小热激蛋白包含与SEQ?ID?NO:1和12-26中所列任何序列有至少50%相同性的氨基酸序列。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】包含小热激蛋白的微粒专利
本专利技术属于医药领域。具体而言，其属于用于治疗炎性疾病的药物领域。专利技术背景小热激蛋白家族以一个共同特点为特征，即存在含90-100个残基的高保守的所谓α晶体蛋白结构域。脊椎动物眼晶状体蛋白-αΑ-和α B-晶体蛋白以及包括HSPBl、HSPB2、HSPB3、HSPB6、HSPB7、HSPB8、HSPB9 和 HSPBlO 在内的 15-30-kDa 热激蛋白普遍存在的群均属于该小热激蛋白组。眼晶状体α晶体蛋白的2个亚基是a A-晶体蛋白(CRYAA)和α B-晶体蛋白(CRYAB)。虽然CRYAA优选在眼晶状体中表达，CRYAB在许多组织和器官中广泛表达。认为小热激蛋白的主要作用是抵消胁迫条件对细胞完整性的去稳定化影响。有证据显示其参与变性疾病等。α晶体蛋白被描述为许多疾病和病症中的潜在药物。W02008073466中，描述了抑制患者炎性疾病的方法，所述方法包含给予患者治疗有效剂量的游离可溶CRYAB蛋白，其中组织内受自身免疫病影响的免疫细胞在该试剂存在下减少活化。W09533997中，描述了游离可溶CRYAB蛋白在多发性硬化中的医学应用。α晶体蛋白家族的蛋白的缺点是这些作为游离可溶蛋白的产品不如预期有效，特别是给予人时。本专利技术的目标是解决此问题。
技术实现思路
本专利技术基于以下发现:小热激蛋白以生物可降解微粒形式给予时相较以其游离可溶形式给予时，能有效得多地激活巨噬细胞。因此，此专利技术方面的小热激蛋白不作为游离可溶蛋白给予。因此，本专利技术提供一种生物可降解微粒，所述生物可降解微粒的直径为0.2-3.5微米，且含药学有效量的诱导巨噬细胞中IL-10产生的至少一种小热激蛋白，所述小热激蛋白包含与SEQ ID NO:1和12-26所列任何序列具有至少50%相同性的氨基酸序列或其组合。与SEQ ID NO:1和12-26所列任何序列有至少50%的氨基酸序列相同性表明所述小热激蛋白包含α晶体蛋白结构域。这种α晶体蛋白结构域是确定其是否激活巨噬细胞的蛋白活性区，巨噬细胞活化通过诱导该巨噬细胞中IL-10产生而趋于明显。α晶体蛋白结构域可与SEQ ID NO:1和12-26具有至少50%，优选至少55%，更优选至少60%、70%、80%、90%或95%的氨基酸序列相同性 。所述小热激蛋白优选是具有选自SEQ ID N0:2-ll的氨基酸序列的蛋白质。所述小热激蛋白更优选是具有SEQ ID Ν0:2的氨基酸序列的蛋白质。在优选实施方式中，所述生物可降解微粒是生物可相容的。在其它优选实施方式中，所述微粒包含己内酯、聚乳酸(PLA)、乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)或乳酸-羟甲基乙醇酸共聚物(PLHMGA)。所述生物可降解微粒优选具有0.2-5 μ m的平均直径，更优选0.2-3.5 μ mD本专利技术还提供根据本专利技术用于对象医学治疗的生物可降解微粒。所述对象优选是人对象。所述医学治疗优选针对炎性疾病。所述炎性疾病优选是皮肤、粘膜、肺、神经系统、血管系统、胰腺或关节的急性或慢性炎症性病症，优选皮炎、牛皮癣、湿疹、克罗恩病、溃疡性结肠炎、牙周炎、扁平苔癣、硬化性苔癣、慢性阻塞性肺疾病、气肿、阿尔茨海默病、帕金森病、痴呆、视神经炎、脑炎、炎性周围神经病、动脉粥样硬化、血管炎、风湿性关节炎或糖尿病。本专利技术还提供含治疗有效剂量的本专利技术所述生物可降解微粒的药物组合物。优选地,药物组合物中存在的至少百分之50、60、70、80或90的微粒是本专利技术的所述生物可降解微粒。本专利技术还提供产生本专利技术所述生物可降解微粒的方法，所述方法包括以下步骤:混合含CRYAB的水溶液与溶于挥发性有机溶剂(优选二氯甲烷(DCM))的己内酯、PLA、PLGA或PLHMGA溶液，以提供水/挥发性有机溶剂二相系统；乳化所述水/挥发性有机溶剂二相系统以提供油包水乳液；向含聚乙烯醇的水溶液中加入所述油包水乳液，并乳化所得混合物以提供水包油包水乳液；使所述挥发性有机溶剂从所述水包油包水乳液中蒸发，并在所述蒸发过程中形成生物 可降解微粒。本专利技术还提供治疗患有炎性疾病的对象的方法，包含给予所述对象治疗有效量的本专利技术的生物可降解微粒或本专利技术的药物组合物。附图简要说明附图说明图1显示基于乳酸和乙醇酸合成具有羟基侧基的亲水性聚酯。图1的反应流程显示亲水性聚酯合成中的关键步骤，所述亲水性聚酯能用于产生比传统聚(乳酸-共-乙醇酸)聚合物更亲水的微球。这种微球的制备由Ghassemi等更详细描述。BMMG 单体中 R=CH3。图2显示基于亲水性PLHMGA聚合物或PLGA聚合物的含CRYAB微球的扫描电子显微照片。图2的图像显示用传统聚(乳酸-共-乙醇酸)聚合物(PLGA)或含羟甲基化聚酯(PLHMGA)的更亲水形式所得微粒的类似大小分布。如实施例中更详细描述制备的PLGA微球的直径一般为0.2-3.5微米，以类似方式制备的PLHMGA微球直径一般为0.2-2微米。图3显示用游离可溶CRYAB (左)和微球包封的CRYAB (右)诱导IL-10。图3的数据显示由微球包封的CRYAB诱导巨噬细胞中IL-10比将巨噬细胞暴露于游离可溶CRYAB有效得多。还显示PLHMGA微粒甚至比PLGA微粒更有效。图4显示α晶体蛋白/小热激蛋白的10个家族成员的序列比对。加框的序列表不保守α晶体蛋白样结构域。图4显示所有目前已知的10种α晶体蛋白/小热激蛋白的序列比对，突出显示称为α晶体蛋白结构域的具显著同源性的蛋白区段。图5显示CRYAB的α晶体蛋白结构域(残基68-148)与其它小热激蛋白的α晶体蛋白结构域之间的同源性。序列相同性由双点指示，结构同源性通过位于残基间的单点指示。此图更详细显示10种不同人小热激蛋白间序列相同性和结构同源性的程度。图6显示空PLGA微球不仅不能诱导人巨噬细胞的IL-10产生，而且不影响由含CRYAB微球诱导的IL-10产生。当将降低浓度的空微球加入人巨噬细胞培养物以补充增加浓度的含CRYAB微球至恒定总微球水平时，反应概况与仅用增加浓度的含CRYAB微球所得的相同。这证实巨噬细胞对含CRYAB的PLGA-微球的反应确实由包封的蛋白介导，而不是该微球介导。具有相同大小和化学特征的空PLGA微球不仅不能诱导任何产生，其还不影响含CRYAB微球对IL-10的诱导。图7显示人血单核细胞源性巨噬细胞和人脑源性小胶质细胞对多个含CRYAB微球的迅速和完全吞噬作用不同于对微球所探求的大部分应用，本专利技术不旨在于数日到数周内从微球缓慢释放治疗蛋白。相反，本专利技术旨在由巨噬细胞迅速摄取含CRYAB微球，并随后迅速释放吞噬体内的治疗蛋白。图3显示此策略如何引起人巨噬细胞中在20小时时间范围内显著产生抗炎因子IL-10。图7中，还显示目前描述的含CRYAB微球如何被不同类型人巨噬细胞迅速和基本完全吞噬。右侧图中，显示24小时时间范围内每个细胞摄入多个微球的巨噬细胞和小胶质细胞。显示此时间阶段中无任何添加培养的细胞或提供游离可溶CRYAB的细胞以用于比较。图8显示由含CRYAB的PLGA微球诱导的人免疫应答的抗炎质量。不同于其它哺乳动物，成年人免疫系统包含应答CRYAB的记忆T细胞以及针对CRYAB的血清抗体。此免疫响答性通过天然过程启动，且在所有人中发现。此情况导致的缺本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·M·范诺尔特，
申请(专利权)人：德尔塔克利斯塔隆有限公司，
类型：
国别省市：