一种黑曲霉顺式环氧琥珀酸水解酶基因及其应用制造技术

一种黑曲霉顺式环氧琥珀酸水解酶基因及其应用，属于生物工程技术领域。本发明专利技术一方面提供了一种黑曲霉顺式环氧琥珀酸水解酶多肽及其编码基因，另一方面提供了该编码基因在生产L(+)‑酒石酸或其盐中的应用，利用本发明专利技术能够实现顺式环氧琥珀酸水解酶的高效表达，为工业化生产L(+)‑酒石酸奠定了基础。

A CIS epoxysuccinate hydrolase gene from Aspergillus niger and its application

The invention relates to a CIS epoxysuccinate hydrolase gene of Aspergillus niger and its application, belonging to the technical field of bioengineering. On the one hand, the invention provides a CIS epoxysuccinate hydrolase polypeptide of Aspergillus niger and its coding gene, on the other hand, it provides the application of the coding gene in the production of L (+) - tartaric acid or its salt, the invention can realize the high-efficiency expression of CIS epoxysuccinate hydrolase, and lay a foundation for the industrial production of L (+) - tartaric acid.

【技术实现步骤摘要】
一种黑曲霉顺式环氧琥珀酸水解酶基因及其应用
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种黑曲霉顺式环氧琥珀酸水解酶基因及其应用。
技术介绍
酒石酸，一种α-羧酸，又名2,3-二羟基琥珀酸或2,3-二羟基丁二酸。1769年，瑞典化学家CarlWilhelmScheele最早在葡萄酒的下脚料粗酒石中发现了L(+)-酒石酸的存在，故名“酒石酸”。L(+)-酒石酸广泛存在于自然界中，故又被称为“天然酒石酸”，特别是罗望子果和葡萄中含量较高，是重要的食品乳化剂、饮料酸味剂、医药拆分剂、石膏缓凝剂、印染防染剂、照相显影剂、金属抛光剂，广泛应用于食品工业、医药化工及建筑业中。微生物转化法是目前L(+)-酒石酸工业化生产的主流方法，即以顺酐为原料，通过水解和环氧化反应变为顺式环氧琥珀酸或其盐，然后利用含有顺式环氧琥珀酸水解酶的微生物，生物催化顺式环氧琥珀酸或其盐生成L(+)-酒石酸或其盐。目前已报道的可用于生产L(+)-酒石酸或其盐的微生物有：诺卡氏菌属(Nocardia)、棒杆菌属(Coryncbacterium)、红球菌属(Rhodococcus)、根瘤菌属(Rhizobium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、无色杆菌属(Achromobacter)、醋酸杆菌属(Acetobacter)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、不动杆菌属(Acinetobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)和双头菌(Labrys)。其中，来源于诺卡氏菌属、红球菌属和克雷伯氏菌属的顺式环氧琥珀酸水解酶的基因序列及其编码的氨基酸序列已报道，并构建了基因工程菌，用于L(+)-酒石酸或其盐的生产。这些已报道的生产L(+)-酒石酸或其盐的菌种均为细菌，未见利用真菌生产L(+)-酒石酸或其盐的报道。一般认为，微生物转化法生产L(+)-酒石酸具有酶立体专一性好、酶促反应快、产品光学纯度和产品得率高、产品分离纯化简单易行等特点。但是由于微生物体内固有的酶系统非常复杂，顺式环氧琥珀酸水解酶的表达量不高，其活性也受到胞内胞外多种因素的制约，导致L(+)-酒石酸生产效率低下。利用基因工程技术构建具有顺式环氧琥珀酸水解酶基因的基因工程菌，可以实现顺式环氧琥珀酸水解酶的高效表达，这也成为工业生产L(+)-酒石酸的关键。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术的目的在于设计提供一种黑曲霉顺式环氧琥珀酸水解酶基因及其应用的技术方案。本专利技术具体通过以下技术方案实现：所述的一种黑曲霉顺式环氧琥珀酸水解酶多肽，其特征在于该多肽的氨基酸序列为：1）SEQIDNo.2所示的氨基酸序列；或2）SEQIDNo.2所示的氨基酸序列经替换、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。所述的一种黑曲霉顺式环氧琥珀酸水解酶多肽在生产L(+)-酒石酸或其盐中的应用。所述的编码黑曲霉顺式环氧琥珀酸水解酶多肽的基因，其特征在于其核苷酸序列为：1）SEQIDNo.1所示的核苷酸；或2）SEQIDNo.1所示的核苷酸序列经取代一个或几个核苷酸，得到编码黑曲霉顺式环氧琥珀酸水解酶多肽的基因序列。所述的编码基因在调控微生物生产L(+)-酒石酸或其盐中的应用。所述的包含编码顺式环氧琥珀酸水解酶多肽基因的重组表达载体。所述的表达黑曲霉顺式环氧琥珀酸水解酶多肽的重组微生物菌株。所述的一种生产L(+)-酒石酸或其盐的方法，利用所述的黑曲霉顺式环氧琥珀酸水解酶多肽与顺式环氧琥珀酸或其盐反应。所述的一种生产L(+)-酒石酸或其盐的方法，利用所述的重组微生物菌株与顺式环氧琥珀酸或其盐反应。所述的一种生产L(+)-酒石酸或其盐的方法，其特征在于具体为：1）在合适的培养基中培养重组微生物菌株；2）将步骤1）中得到的重组微生物菌株的细胞、细胞抽提物或无细胞抽提物或由所述重组微生物菌株纯化的顺式环氧琥珀酸水解酶固定在固体支持物上或包埋在固定载体中；3）将步骤1）中得到的重组微生物菌株或步骤2）中得到的制备物与顺式环氧琥珀酸或其盐在适于水解的条件下反应以生产L(+)-酒石酸或其盐；和4）任选地重复利用上述固定或包埋的酶和/或细胞。本专利技术一方面提供了一种黑曲霉顺式环氧琥珀酸水解酶多肽及其编码基因，另一方面提供了该编码基因在生产L(+)-酒石酸或其盐中的应用，利用本专利技术能够实现顺式环氧琥珀酸水解酶的高效表达，为工业化生产L(+)-酒石酸奠定了基础。附图说明图1为本专利技术实施例4中的重组工程菌经过IPTG诱导后的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。具体实施方式为更进一步阐述本专利技术为达成预定专利技术目的所采取的技术手段及功效,以下结合较佳实施例，对依据本专利技术提出的顺式环氧琥珀酸水解酶的编码基因、其编码的多肽及其相关应用其具体实施方式、结构、特征及其功效，详细说明如后。本专利技术的整体思路包括以下几点：从黑曲霉发酵液中分离纯化顺式环氧琥珀酸水解酶，对顺式环氧琥珀酸水解酶的N-末端和C-末端进行测序，根据此N-末端和C-末端的氨基酸序列设计简并引物，从黑曲霉中克隆顺式环氧琥珀酸水解酶基因，构建原核表达载体，转化大肠杆菌，对转入顺式环氧琥珀酸水解酶基因的大肠杆菌进行培养，验证顺式环氧琥珀酸水解酶基因的功能。以上各点皆为单独实施例，以下将结合具体实施例并配合附图作进一步详细说明。实施例1：黑曲霉顺式环氧琥珀酸水解酶的分离纯化本专利技术采用菌株为黑曲霉WH-2(AspergillusnigerWH-2)，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏登记号为CGMCCNo.16799,命名为黑曲霉(Aspergillusniger)WH-2，保藏日：2018年12月03日，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所（邮编：100101）。该黑曲霉(Aspergillusniger)WH-2已在公开号为CN109609388A的专利技术专利中公开。取黑曲霉(Aspergillusniger)WH-2保存于PDA斜面培养基，该斜面培养基的配置方法为：称取200g去皮的新鲜土豆，将土豆切成小块放入锅中，加水1000ml，加热至沸腾，保持30min。再用双层纱布趁热在量杯上过滤，留下滤液。加入20g葡萄糖和15～20g的琼脂，并将滤液补充至1000ml，121℃高压灭菌20min。灭菌完成后，在紫外线灭菌过的超净台上倒入已灭菌的茄形瓶，待茄形瓶中斜面培养基冷却凝固后，将其密封并室内倒置放一夜。若斜面培养基上没有长菌，将其放入4℃冰箱备用。1：黑曲霉顺式环氧琥珀酸水解酶的分离纯化(1)在长满黑曲霉WH-2浓密孢子的斜面培养基上，加入5mL孢子悬浮液，用接种铲刮取孢子，使孢子充分被洗下，用无菌的三层擦镜纸过滤除去菌丝体。该孢子悬浮液配方为0.1%Tween80和0.9%NaCl。(2)过滤后的上述本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种黑曲霉顺式环氧琥珀酸水解酶多肽，其特征在于该多肽的氨基酸序列为：/n1）SEQ ID No.2 所示的氨基酸序列 ；或/n2）SEQ ID No.2 所示的氨基酸序列经替换、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种黑曲霉顺式环氧琥珀酸水解酶多肽，其特征在于该多肽的氨基酸序列为：
1）SEQIDNo.2所示的氨基酸序列；或
2）SEQIDNo.2所示的氨基酸序列经替换、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。


2.如权利要求1所述的一种黑曲霉顺式环氧琥珀酸水解酶多肽在生产L(+)-酒石酸或其盐中的应用。


3.编码权利要求1所述的黑曲霉顺式环氧琥珀酸水解酶多肽的基因，其特征在于其核苷酸序列为：
1）SEQIDNo.1所示的核苷酸；或
2）SEQIDNo.1所示的核苷酸序列经取代一个或几个核苷酸，得到编码顺式环氧琥珀酸水解酶多肽的基因序列。


4.如权利要求3所述的编码基因在调控微生物生产L(+)-酒石酸或其盐中的应用。


5.包含权利要求3所述编码基因的重组表达载体。


6.表达如权利要求1所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：鲍文娜，刘士旺，陈怡，廖鸿秀，黄倩倩，房蕊，黄温迪，
申请(专利权)人：浙江科技学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33