一种聚磷酸激酶RmPPK及其编码基因和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种聚磷酸激酶RmPPK及其编码基因和应用。所述聚磷酸激酶RmPPK的氨基酸序列为：SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，或者对SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加修饰且具有相同功能的氨基酸序列；或者与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有60％以上同源性且具有相同功能的氨基酸序列。本发明专利技术将聚磷酸激酶基因RmPPK导入大肠杆菌BL21(DE3)中进行高效表达获得聚磷酸激酶RmPPK。获得的聚磷酸激酶RmPPK是一种新型聚磷酸激酶PPK，为CTP、CMP‑唾液酸、UTP、UDP‑Glc/UDP‑GlcA/UDP‑GlcNAc/UDP‑Gal/UDP‑GalNAc/UDP‑Xyl、GTP或GDP‑Fuc/GDP‑Man等的再生提供了一种新型工具酶。

A polyphosphate kinase rmppk and its coding gene and Application

The invention discloses a polyphosphate kinase rmppk, a coding gene and an application thereof. The amino acid sequence of the polyphosphate kinase rmppk is: the amino acid sequence shown in SEQ ID No.1, or the amino acid sequence shown in SEQ ID No.1 with one or more amino acid substitutions, deletions or addition modifications and the same function; or the amino acid sequence with more than 60% homology and the same function with the amino acid sequence shown in SEQ ID No.1. The invention introduces the polyphosphate kinase gene rmppk into the Escherichia coli BL21 (DE3) for high-efficiency expression to obtain the polyphosphate kinase rmppk. The obtained polyphosphate kinase rmppk is a new polyphosphate kinase PPK, which provides a new tool enzyme for the regeneration of CTP, CMP \u2011 sialic acid, UTP, UDP \u2011 GLC / UDP \u2011 glca / UDP \u2011 GlcNAc / UDP \u2011 Gal / UDP \u2011 GalNAc / UDP \u2011 xyl, GTP or GDP \u2011 fuc / GDP \u2011 man.

【技术实现步骤摘要】
一种聚磷酸激酶RmPPK及其编码基因和应用
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种聚磷酸激酶RmPPK及其编码基因和应用。
技术介绍
多聚磷酸(Polyphosphate，PolyP)是一种线型高分子，由三到几百甚至上千个单体组成。PolyP不仅存在于细菌中，也存在于哺乳动物的肾脏、心脏、大脑等器官中(KampingaHH,MolecularCell.2014,53,685-687)。在没有ATP提供能量的最原始生物体内，PolyP充当磷酸和能量的储存库，是ATP相似的高能磷酸酐，对生物起源起到了重要作用(RaoNN,etal.,AnnualReviewofBiochemistry,2009,78,605-647)。多聚磷酸激酶(Polyphosphatekinase，PPK)可以催化ATP转化为PolyP，且该反应为可逆反应，因此它也可以以PolyP作为磷酸供体催化ADP转化为ATP，以实现能量的循环(AndexerJN,andRichterM,ChemBioChem2015,16,380-386)。根据PPK的结构和分子量大小，PPK主要被分为两类：催化合成PolyP的PPK1和催化分解PolyP的PPK2(AndexerJN,andRichterM,ChemBioChem2015,16,380-386)。PPK1存在于多种病原体微生物中，通常由600到700个氨基酸组成，更倾向于以ATP为底物，大肠杆菌来源的PPK1合成与利用PolyP的速率比为4:1。另一种被研究较多的PPK为PPK2。PPK2与PPK1几乎没有氨基酸序列同源性，比PPK1短很多(由230个左右氨基酸组成)，倾向于以PolyP和ADP/GDP为底物催化合成ATP/GTP。由于ATP/GTP/UTP/CTP等三磷酸核苷的价格相对昂贵，若能建立一个循环反应系统：由ATP/GTP/UTP/CTP降解而来的ADP/GDP/UDP/CDP(或AMP/GMP/UMP/CMP)通过其它途径再合成ATP/GTP/UTP/CTP，使ATP/GTP/UTP/CTP能够循环使用，这样就有可能采用能够再生ATP/GTP/UTP/CTP的廉价原料来替代ATP/GTP/UTP/CTP，从而提高有用物质生产过程的经济性。目前关于NTP再生系统的研究报道大部分集中在ADP转化为ATP上，而针对GTP/UTP/CTP再生(把GDP/UDP/CDP转化为GTP/UTP/CTP)的研究还非常少(AndexerJN,andRichterM,ChemBioChem2015,16,380-386)。因此，开发一类新型多功能多聚磷酸激酶，对能够利用廉价PolyP原料进行ATP/GTP/UTP/CTP的再生(即把ADP/GDP/UDP/CDP催化转化为ATP/GTP/UTP/CTP)具有广泛的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的是，提供一种聚磷酸激酶RmPPK及其编码基因和应用。本专利技术的另一目的是，提供包含所述聚磷酸激酶RmPPK编码基因的重组载体以及高效表达该RmPPK的重组菌株。本专利技术旨在提供一种新型的聚磷酸激酶。本专利技术为实现上述目的所采用的技术方案如下：一种聚磷酸激酶RmPPK，所述聚磷酸激酶的氨基酸序列选自以下其中一种：(1)如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列；(2)对SEQIDNO.1所示的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加修饰且具有相同功能的氨基酸序列；(3)与SEQIDNO.1所示的氨基酸序列具有60％以上同源性且具有相同功能的氨基酸序列。本专利技术还提供一种聚磷酸激酶基因RmPPK，所述基因编码上述聚磷酸激酶RmPPK。优选地，所述聚磷酸激酶基因RmPPK的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术还提供一种重组表达载体，该重组表达载体包含所述聚磷酸激酶基因RmPPK。优选地，所述重组表达载体为pET28a-RmPPK。本专利技术还提供包含上述重组表达载体的重组菌。优选地，所述重组菌为大肠杆菌BL21(DE3)。本专利技术还提供所述聚磷酸激酶RmPPK的制备方法，包括以下步骤：1)构建包含聚磷酸激酶RmPPK的重组表达载体，将重组表达载体转化至宿主细胞，得到重组菌；2)培养重组菌株使其发酵，诱导聚磷酸激酶RmPPK表达；3)收集菌体，破碎菌体细胞，离心收集上清液；4)对收集的上清液的进行纯化，获得聚磷酸激酶RmPPK。优选地，所述步骤4)中上清液的的纯化方式为镍柱纯化，洗脱液为缓冲溶液+120-180mM咪唑。优选地，所述缓冲溶液为50mMTris/HCl,pH8.0,0.5MNaCl。本专利技术还提供了上述聚磷酸激酶RmPPK在CTP、CMP-唾液酸、UTP、UDP-Glc/UDP-GlcA/UDP-GlcNAc/UDP-Gal/UDP-GalNAc/UDP-Xyl、GTP或GDP-Fuc/GDP-Man再生过程中的应用。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：本专利技术的聚磷酸激酶RmPPK是一种新型聚磷酸激酶PPK，该聚磷酸激酶为CTP、CMP-唾液酸、UTP、UDP-Glc/UDP-GlcA/UDP-GlcNAc/UDP-Gal/UDP-GalNAc/UDP-Xyl、GTP或GDP-Fuc/GDP-Man等的再生提供了一种新型工具酶，对于利用廉价PolyP原料进行ATP/GTP/UTP/CTP的再生具有广泛的应用前景。附图说明图1为本专利技术实施例中表达质粒pET28a-RmPPK的图谱示意图。图2为本专利技术实施例2中RmPPK镍柱纯化的SDS-PAGE电泳图。图3为本专利技术实施例3中表达的多聚磷酸激酶RmPPK的活性分析HPLC检测结果。图4为本专利技术实施例4中CTP或CMP-唾液酸再生的路线图。图5为本专利技术实施例4中RmPPK参与CTP或CMP-唾液酸再生的产物的HPLC分析图。图6为本专利技术实施例4中产物6’-SL的1H-NMR谱图。图7为本专利技术实施例4中产物6’-SL的13C-NMR谱图。图8为本专利技术实施例4中产物6’-SL的质谱图。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术的技术方案进行详细说明。以下采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。本专利技术中的载体(vector)是指能够将DNA片段转移到受体细胞中的一种能自我复制的环状DNA分子。“同源性”或“同源性百分比”是指两个氨基酸序列之间或两个核酸序列之间的序列同一性。为确定两个氨基酸序列或两个核酸的同源性百分比，以最佳比较目的对序列进行比对。两个序列之间的同源性百分比是这些序列共有的相同位置的数目的函数(即，同源性百分比＝相同位置的数目/位置的总数(例如，重叠位置)×100)。例如，“同源性百分比”通过下列方式来计算：在比较窗中比较两个经最佳比对的序列，测定在两个序列中出现相同核苷酸碱基本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种聚磷酸激酶RmPPK，其特征在于，所述聚磷酸激酶的氨基酸序列选自以下其中一种：/n(1)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；/n(2)对SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加修饰且具有相同功能的氨基酸序列；/n(3)与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有60％以上同源性且具有相同功能的氨基酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种聚磷酸激酶RmPPK，其特征在于，所述聚磷酸激酶的氨基酸序列选自以下其中一种：
(1)如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列；
(2)对SEQIDNO.1所示的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加修饰且具有相同功能的氨基酸序列；
(3)与SEQIDNO.1所示的氨基酸序列具有60％以上同源性且具有相同功能的氨基酸序列。


2.一种聚磷酸激酶基因RmPPK，其特征在于：所述基因编码权利要求1所述的聚磷酸激酶RmPPK。


3.如权利要求2所述的一种聚磷酸激酶基因RmPPK，其特征在于：该基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。


4.包含权利要求2或3所述聚磷酸激酶基因RmPPK的重组表达载体。


5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为pET28a-RmPPK。


6.包含权利要求4或5所述重组表达载体的重组菌。

【专利技术属性】
技术研发人员：李建军，杜昱光，胥华，孙明，王倬，焦思明，任立世，
申请(专利权)人：中科荣信苏州生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32