本发明专利技术公开了一种PD‑1的纳米抗体的VHH链，包括框架区FR和互补决定区CDR，公开了框架区FR选自下组的FR的氨基酸序列和互补决定区CDR氨基酸序列，本发明专利技术还公开了一种PD‑1纳米抗体，还公开了一种DNA分子，它编码本发明专利技术所述的PD‑1的纳米抗体的VHH链或本发明专利技术所述的PD‑1纳米抗体，还公开了一种宿主细胞，它可以表达PD‑1的纳米抗体，还公开了该PD‑1纳米抗体用于检测PD‑1的用途。通过本发明专利技术所公布的纳米抗体基因序列及宿主细胞，该纳米抗体能够在大肠杆菌内高效表达，应用于PD‑1检测试剂及生物制药的研发。
Nano antibody of PD-1 and its clinical application
The invention discloses a VHH chain of PD \u2011 1 nano antibody, including frame area FR and complementary decision area CDR, amino acid sequence of frame area fr selected from the fr of the next group and CDR amino acid sequence of complementary decision area, the invention also discloses a PD \u2011 1 nano antibody and a DNA molecule, which encodes the VHH chain of PD \u2011 1 nano antibody or the P chain of the invention D \u2011 1 nano antibody also discloses a host cell, which can express PD \u2011 1 nano antibody, and also discloses the use of PD \u2011 1 nano antibody for detection of PD \u2011 1. Through the gene sequence and host cell of the nano antibody disclosed by the invention, the nano antibody can be efficiently expressed in E.coli, and is applied to the research and development of PD \u2011 1 detection reagent and biopharmaceutical.
【技术实现步骤摘要】
PD-1的纳米抗体及其临床应用
本专利技术属于生物医学或生物制药
，涉及针对于PD-1的纳米抗体及其编码序列。
技术介绍
生物学家Ward在1989年分离检测骆驼血清中抗体时发现，骆驼血液中除了常规的四链抗体外，还有一些仅含重链的抗体。1993年，科学家Hamers-Casterman等研究表明，骆驼抗体天然缺失轻链，只含有重链，因此又称为重链抗体(heavychainantibodies，HCAbs)。另有研究者发现，骆驼抗体中还缺少CH1。克隆重链抗体的可变区得到只由一个重链可变区组成的单域抗体，称为VHH抗体(Variabledomainofheavychainofheavy-chainantibody，VHH)。VHH晶体直径2.5nm，长4nm，因此又称为纳米抗体(nanobody，Nb)，是自然存在的可与抗原结合的最小片段。纳米粒子具有的颗粒尺寸小、比表面积大、表面能高等特点，以及表面效应、尺寸效应和宏观量子隧道效应使得纳米抗体在诸多方面均优于传统抗体。纳米抗体在疾病的检测和治疗方面具有显著的应用成果。程序性细胞死亡蛋白-1(programmeddeath-1，PD-1)是一种共刺激分子，属于CD28家族，呈诱导性表达于活化的T细胞、B细胞和NK细胞表面，与其配体作用传递抑制性信号，发挥负向调控作用，这一信号在自身免疫性疾病、肿瘤发生、慢病毒感染中具有重要的生物学意义。PD-1通过与程序性细胞死亡因子配体1或者2结合后，招募并激活蛋白络氨酸磷酸酶等激活信号通路，对T细胞免疫起到负向调节的功能。PD-1还可以通过抑制辅助性T细胞间接影响体液免疫或者直接通过与B细胞上的PD-1结合影响抗体分泌。PD-1信号异常可以引起体内免疫微环境失去稳态，导致自身免疫性疾病或者肿瘤发生。因此利用抗PD-1的纳米抗体封闭PD-1信号通路，可以减弱对活化的T细胞抑制作用，从而增强抗肿瘤的功能。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术所要解决的技术问题是提供一种针对PD-1的纳米抗体，同时提供该纳米抗体的编码序列及该纳米抗体在制备检测的应用。技术方案：本专利技术的技术方案为：本专利技术的第一方面，提供了一种针对PD-1重链抗体VHH，包括框架区FR和互补决定区CDR，所述框架区FR选自下组的FR的氨基酸序列：SEQIDNO：1所示的FR1，SEQIDNO：2所示的FR2，SEQIDNO：3所示的FR3，SEQIDNO：4所示的FR4。所述互补决定区CDR选自下组的CDR的氨基酸序列：SEQIDNO：5所示的CDR1，SEQIDNO：6所示的CDR2，SEQIDNO：7所示的CDR3。优选地，所述的PD-1纳米抗体的VHH链，它具有SEQIDNO：8所示的氨基酸序列。本专利技术第二方面，一种针对PD-1重链抗体VHH，此抗体特异性识别PD-1抗原，包括一条具有SEQIDNO：8所示氨基酸序列的VHH链。本专利技术第三方面，提供了一种DNA分子，它编码选自下组的蛋白质：本专利技术所述的PD-1重链抗体VHH。优选地，所述的DNA分子，其特征在于，它具有选自下组的DNA序列：SEQIDNO：9。有益效果：与现有技术相比，本专利技术的优点如下：本专利技术将血液中提取的PD-1免疫新疆单峰驼，随后利用该骆驼外周血淋巴细胞建立了针对于PD-1的纳米抗体基因库，试验中将PD-1偶联在酶标板上，以此形式的抗原利用噬菌体展示技术筛选免疫性的纳米抗体基因库(骆驼重链抗体噬菌体展示基因库)，从而获得了针对PD-1特异性的纳米抗体基因，将此基因转至大肠杆菌中，从而建立了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株。附图说明图1是用噬菌体的酶联免疫方法(ELISA)筛选特异性单个阳性克隆的模式图；其中1是将PD-1蛋白偶联在酶标板上，2是纳米抗体，3是鼠抗HA抗体，4是山羊抗小鼠碱性磷酸酶标记的抗体，5是碱性磷酸酶显色液。图2是表达的PD-1纳米抗体，经镍柱树脂凝胶亲和层析纯化后的SDS-PAGE的电泳图；其中泳道1是蛋白分子标准，其余泳道是250毫摩尔咪唑洗脱液所洗脱下来的纳米抗体，结果显示PD-1纳米抗体经过该纯化过程，其纯度可达到95％以上。图3是PD-1纳米抗体检测特异性分析的结果图。具体实施方式本专利技术首先将PD-1的可溶性蛋白作为抗原免疫一只新疆单峰驼，经过5次免疫之后提取该单峰驼外周血淋巴细胞并构建了PD-1特异的单域重链抗体文库。将PD-1偶联在NUNC酶标板上，展示蛋白质的正确空间结构，使得PD-1的抗原表位得以暴露出来，以此形式的抗原利用噬菌体展示技术筛选PD-1免疫性的纳米抗体基因库(骆驼重链抗体噬菌体展示基因库)，而获得了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株。下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。实施例1针对于PD-1的纳米抗体文库的构建：(1)首先合成抗原PD-1，用于免疫所用的PD-1的浓度为500μg/mL，每次免疫将0.5mgPD-1与弗氏佐剂等体积混合，免疫一只新疆单峰驼(句容圣龙家畜养殖厂)，每周一次，共免疫5次，除第一次使用完全的弗氏佐剂(购自sigma)，剩余几次全部使用弗式不全佐剂(购自sigma)，免疫过程中刺激B细胞表达抗原特异性的纳米抗体。(2)5次免疫结束后，提取骆驼外周血淋巴细胞100mL并提取总RNA参照QIAGEN公司提供的RNA提取试剂盒。(3)按照Super-ScriptIIIFIRSTSTRANDSUPERMIX试剂盒说明书，将提取的RNA反转录成cDNA。用巢式PCR扩增重链抗体的可变区片段：第一轮PCR：上游引物：GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGGC下游引物：GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC扩增重链抗体引导肽和抗体CH2之间的片段，54℃退火，25个循环；结果显示该片段的大小约为700bp，即纳米抗体基因电泳带约为700bp。。第二轮PCR：以第一轮PCR产物作模板，上游引物：GATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGRGGAGG下游引物：GGACTAGTGCGGCCGCTGGAGACGGTGACCTGGGT扩增重链抗体FR1区和长、短铰链区之间的片段(长片段和短片段)，60℃退火，17个循环，回收目的片段，结果显示，该片段的大小约为500bp，即纳米抗体基因电泳带长度约为500bp。(4)使用限制性的内切酶(购自NEB)PstI及NotI酶切20μgpComb3噬菌体展示载体(Biovector供应)及10μgVHH并用T4DNA连接酶(购自TaKaRa公司)连接两个片段。(5)将连接产物电转化至电转感受态细胞TG1(北京神州红叶科技有限公司)中，构建PD-1的纳米抗体噬菌体展示文库并测定库容，库容的大小为3.1×108。与此同时，通过菌落PCR检测引物使用第二轮PCR引物，Tm55℃。文库构建完成后，为检测文库的插入率，随机选取单颗克隆做菌落PCR。结果显示插入率已达到90％以上。实施例2针对PD-1的纳米抗体筛选过程：(1)将溶解在PBS中的100μg/mL的PD-1包被在NUNC酶标板上，4℃放置过夜，同时设立负对照。(2)第二天两个孔中分别加入200μL1％牛奶，室温封闭2小时。(3)2小时后，加入100μL噬菌体(8×1011tfu免疫骆驼纳米抗体噬菌展示基因库)，在室本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.PD‑1纳米抗体的VHH链，包括框架区FR和互补决定区CDR，所述框架区FR选自下组的FR的氨基酸序列：SEQIDNO：1所示的FR1，SEQIDNO：2所示的FR2，SEQIDNO：3所示的FR3，SEQIDNO：4所示的FR4；所述互补决定区CDR选自下组的CDR的氨基酸序列：SEQIDNO：5所示的CDR1，SEQIDNO：6所示的CDR2，SEQIDNO：7所示的CDR3。
【技术特征摘要】
1.PD-1纳米抗体的VHH链，包括框架区FR和互补决定区CDR，所述框架区FR选自下组的FR的氨基酸序列：SEQIDNO：1所示的FR1，SEQIDNO：2所示的FR2，SEQIDNO：3所示的FR3，SEQIDNO：4所示的FR4；所述互补决定区CDR选自下组的CDR的氨基酸序列：SEQIDNO：5所示的CDR1，SEQIDNO：6所示的CDR2，SEQIDNO：7所示的CDR3。2.根据权利要求1所...
【专利技术属性】
技术研发人员：劳英斌，张晴晴，焦力，姚紫娟，孙建飞，
申请(专利权)人：南京东极医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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