抗CD19纳米抗体的制备制造技术

本发明专利技术公开了一种CD19的纳米抗体的VHH链，包括框架区FR和互补决定区CDR，公开了框架区FR选自下组的FR的氨基酸序列和互补决定区CDR氨基酸序列，本发明专利技术还公开了一种CD19纳米抗体，还公开了一种DNA分子，它编码本发明专利技术所述的CD19的纳米抗体的VHH链或本发明专利技术所述的CD19纳米抗体，还公开了一种宿主细胞，它可以表达CD19的纳米抗体，还公开了该CD19纳米抗体用于检测CD19的用途。通过本发明专利技术所公布的纳米抗体基因序列及宿主细胞，该纳米抗体能够在大肠杆菌内高效表达，应用于CD19检测试剂及生物制药的研发。

Preparation of anti-CD19 nano antibody

【技术实现步骤摘要】
抗CD19纳米抗体的制备
本专利技术属于生物医学或生物制药
，涉及针对于CD19的纳米抗体及其编码序列。
技术介绍
1989年布鲁塞尔自由大学的Muyldermans偶然发现骆驼血液中有半数的抗体是天然缺失轻链。4年后，与其导师Hamers教授在Nature发文阐述了该类重链抗体特性。源于骆驼的SdAb，即纳米抗体（Nanobody，Nb），相对分子质量小于15KD，其内部存在二硫键，表面有大量亲水残基，对热和pH值有较强的抵抗力。具有常规单域抗体无法比拟的水溶性和构象稳定性。这种单体结构域能高特异性、高亲和力地与抗原结合，从而中和或者封闭相对隐蔽的抗原表位。凭借以上特性，Nb较之常规单域抗体收到了更加广泛的关注和认可。随着1994年第一个Nb的氨基酸序列测定以后，便进入了对Nb结构、特性和生产、应用的探索与开发研究阶段，纳米抗体技术的研发也将大大提高人类疾病的诊断与治疗水平。急性淋巴细胞白血病（ALL）是血液系统常见恶性疾病之一，B细胞系ALL（B-ALL）占ALL的70%-80%，在儿童恶性血液病中尤为多见。目前成人ALL的疗效较差、生存期较短，单独应用联合化疗方法难以取得满意的疗效，需要结合骨髓移植、生物治疗及免疫治疗等多种手段进行综合治疗。研究表明，ALL白血病细胞表面免疫共刺激分子B7.1表达低下或缺乏，是导致白血病细胞不能被机体细胞毒性T细胞（CTL）有效地识别杀伤，从而逃逸宿主免疫监视的重要原因之一。然而几乎所有的B-ALL病例均高表达CD19表面抗原。因此可以利用CD19表面抗原作为ALL白血病细胞的表面标记，构建抗CD19纳米抗体-B7.1融合蛋白、表达融合蛋白，通过融合蛋白中抗CD19纳米抗体，将B7.1结合到ALL白血病细胞表面，刺激肿瘤特异性CTL细胞活化，从而起到杀伤白血病细胞的作用。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术所要解决的技术问题是提供一种针对CD19的纳米抗体，同时提供该纳米抗体的编码序列及该纳米抗体在制备检测的应用。技术方案：本专利技术的技术方案为：本专利技术的第一方面，提供了一种针对CD19重链抗体VHH，包括框架区FR和互补决定区CDR，所述框架区FR选自下组的FR的氨基酸序列：SEQIDNO：1所示的FR1，SEQIDNO：2所示的FR2，SEQIDNO：3所示的FR3，SEQIDNO：4所示的FR4。所述互补决定区CDR选自下组的CDR的氨基酸序列：SEQIDNO：5所示的CDR1，SEQIDNO：6所示的CDR2，SEQIDNO：7所示的CDR3。优选地，所述的CD19纳米抗体的VHH链，它具有SEQIDNO：8所示的氨基酸序列。本专利技术第二方面，一种针对CD19重链抗体VHH，此抗体特异性识别CD19抗原，包括一条具有SEQIDNO：8所示氨基酸序列的VHH链。本专利技术第三方面，提供了一种DNA分子，它编码选自下组的蛋白质：本专利技术所述的CD19重链抗体VHH。优选地，所述的DNA分子，其特征在于，它具有选自下组的DNA序列：SEQIDNO：9。有益效果：与现有技术相比，本专利技术的优点如下：本专利技术将血液中提取的CD19免疫新疆单峰驼，随后利用该骆驼外周血淋巴细胞建立了针对于CD19的纳米抗体基因库，试验中将CD19偶联在酶标板上，以此形式的抗原利用噬菌体展示技术筛选免疫性的纳米抗体基因库（骆驼重链抗体噬菌体展示基因库），从而获得了针对CD19特异性的纳米抗体基因，将此基因转至大肠杆菌中，从而建立了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株。附图说明图1是用噬菌体的酶联免疫方法（ELISA）筛选特异性单个阳性克隆的模式图；其中1是将CD19蛋白偶联在酶标板上，2是纳米抗体，3是鼠抗HA抗体，4是山羊抗小鼠碱性磷酸酶标记的抗体，5是碱性磷酸酶显色液。图2是表达的CD19纳米抗体，经镍柱树脂凝胶亲和层析纯化后的SDS-PAGE的电泳图；其中泳道1是蛋白分子标准，其余泳道是250毫摩尔咪唑洗脱液所洗脱下来的纳米抗体，结果显示CD19纳米抗体经过该纯化过程，其纯度可达到95%以上。图3是CD19纳米抗体在不同环境温度下的耐受性检测。具体实施方式本专利技术首先将CD19的可溶性蛋白作为抗原免疫一只新疆单峰驼，经过5次免疫之后提取该单峰驼外周血淋巴细胞并构建了CD19特异的单域重链抗体文库。将CD19偶联在NUNC酶标板上，展示蛋白质的正确空间结构，使得CD19的抗原表位得以暴露出来，以此形式的抗原利用噬菌体展示技术筛选CD19免疫性的纳米抗体基因库（骆驼重链抗体噬菌体展示基因库），而获得了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株。下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。实施例1针对于CD19的纳米抗体文库的构建：（1）首先合成抗原CD19，用于免疫所用的CD19的浓度为500μg/mL，每次免疫将0.5mgCD19与弗氏佐剂等体积混合，免疫一只新疆单峰驼(句容圣龙家畜养殖厂)，每周一次，共免疫5次，除第一次使用完全的弗氏佐剂（购自sigma），剩余几次全部使用弗式不全佐剂（购自sigma），免疫过程中刺激B细胞表达抗原特异性的纳米抗体。（2）5次免疫结束后，提取骆驼外周血淋巴细胞100mL并提取总RNA参照QIAGEN公司提供的RNA提取试剂盒。（3）按照Super-ScriptIIIFIRSTSTRANDSUPERMIX试剂盒说明书，将提取的RNA反转录成cDNA。用巢式PCR扩增重链抗体的可变区片段：第一轮PCR：上游引物：GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGGC下游引物：GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC扩增重链抗体引导肽和抗体CH2之间的片段，54℃退火，25个循环；结果显示该片段的大小约为700bp，即纳米抗体基因电泳带约为700bp。第二轮PCR：以第一轮PCR产物作模板，上游引物：GATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGRGGAGG下游引物：GGACTAGTGCGGCCGCTGGAGACGGTGACCTGGGT扩增重链抗体FR1区和长、短铰链区之间的片段（长片段和短片段），60℃退火，17个循环，回收目的片段，结果显示该片段的大小约为500bp，即纳米抗体基因电泳带约为500bp。（4）使用限制性的内切酶（购自NEB）PstI及NotI酶切20μgpComb3噬菌体展示载体（Biovector供应）及10μgVHH并用T4DNA连接酶（购自TaKaRa公司）连接两个片段。（5）将连接产物电转化至电转感受态细胞TG1（北京神州红叶科技有限公司）中，构建CD19的纳米抗体噬菌体展示文库并测定库容，库容的大小为3.1×108。与此同时，通过菌落PCR检测引物使用第二轮PCR引物，Tm55℃。文库构建完成后，为检测文库的插入率，随机选取24颗克隆做菌落PCR。结果显示插入率已达到90%以上。实施例2针对CD19的纳米抗体筛选过程：(1)将溶解在PBS中的100μg/mL的CD19包被在NUNC酶标板上，4℃放置过夜，同时设立负对照。(2)第二天两个孔中分别加入200μL1％牛奶，室温封闭2小时。(3)2小时后，加入100μL噬菌体(8×1011tfu免疫骆驼纳米抗体噬菌展示基因库)，在室温下作用1小时。(4)用PBST(PBS中含有0.05％吐温20)洗5遍，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.CD19纳米抗体的VHH链，包括框架区FR和互补决定区CDR，所述框架区FR选自下组的FR的氨基酸序列：SEQ ID NO：1所示的FR1，SEQ ID NO：2所示的FR2，SEQ ID NO：3所示的FR3，SEQ ID NO：4所示的FR4；所述互补决定区CDR选自下组的CDR的氨基酸序列：SEQ ID NO：5所示的CDR1，SEQ ID NO：6所示的CDR2，SEQ ID NO：7所示的CDR3。

【技术特征摘要】
1.CD19纳米抗体的VHH链，包括框架区FR和互补决定区CDR，所述框架区FR选自下组的FR的氨基酸序列：SEQIDNO：1所示的FR1，SEQIDNO：2所示的FR2，SEQIDNO：3所示的FR3，SEQIDNO：4所示的FR4；所述互补决定区CDR选自下组的CDR的氨基酸序列：SEQIDNO：5所示的CDR1，SEQIDNO：6所示的CDR2，SEQIDNO：7所示的CDR3。2.根据权利要求1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：劳英斌，张晴晴，焦力，姚紫娟，孙建飞，
申请(专利权)人：南京东极医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32