抗CD20纳米抗体的制备制造技术

本发明专利技术公开了一种CD20的纳米抗体的VHH链，包括框架区FR和互补决定区CDR，公开了框架区FR选自下组的FR的氨基酸序列和互补决定区CDR氨基酸序列，本发明专利技术还公开了一种CD20纳米抗体，还公开了一种DNA分子，它编码本发明专利技术所述的CD20的纳米抗体的VHH链或本发明专利技术所述的CD20纳米抗体，还公开了一种宿主细胞，它可以表达CD20的纳米抗体，还公开了该CD20纳米抗体用于检测CD20的用途。通过本发明专利技术所公布的纳米抗体基因序列及宿主细胞，该纳米抗体能够在大肠杆菌内高效表达，应用于CD20检测试剂及生物制药的研发。

Preparation of anti-CD20 nano antibody

【技术实现步骤摘要】
抗CD20纳米抗体的制备
本专利技术属于生物医学或生物制药
，涉及针对于CD20的纳米抗体及其编码序列。
技术介绍
1975年杂交瘤技术的问世拉开了单克隆抗体用于人类疾病诊断与治疗的序幕，然而单抗体积大、稳定性差，并具有免疫源性，使其在临床上的应用受到一定限制。20世纪80年代以后，新型基因工程抗体不断出现，包括嵌合抗体、人源化抗体、全人源抗体和小型化基因工程抗体，单域抗体是一种小型化基因工程抗体，但是它在稳定性、表达产量、蛋白酶抵抗性和聚合性方面仍有待改进。1993年Hamers-Casterman报道了在骆驼科动物体内发现了一种天然缺失轻链的抗体，即重链抗体，其抗原结合位点仅由重链的可变区（VHH）构成，称为VHH抗体，是目前可以得到的具有完整功能的最小抗体分子片段。一般来说，scFv相对分子质量约为30KD，而VHH抗体的相对分子质量为15KD，仅为常规抗体的1/10，其分子高度4.8nm，直径在2.2nm，故又称为纳米抗体（Nanobody）。与常规抗体相比，纳米抗体具有诸多优势：1）分子量小，可穿透血脑屏障，较易作用于病灶区；2）在原核或者真核系统中可高表达；3）特异性强、亲和力高；4）高耐热性和化学稳定性；5）对人的免疫原性弱。非霍奇金淋巴瘤（NHL）是最常见的淋巴系统恶性肿瘤，好发于青壮年，其中绝大多数为B细胞来源，约占85%。CD20分子在95%以上的B细胞性NHL中均有表达，且抗原分子在细胞膜上比较容易暴露，容易接近，与单抗结合后无显著内化和脱落，也不会因与抗体的结合而发生抗原调变，因此成为治疗B细胞淋巴瘤的理想靶点。目前已有人鼠嵌合抗CD20抗体上市（Rituximab-C2B8）。尽管Rituximab在临床治疗中已经显示出较好的疗效，但是仍有部分的患者对于Rituximab的治疗不产生反应，且单独使用该药物治愈率仅为10%，大部分患者会产生复发和抵抗，并且具有产生人抗鼠抗体（HAMA）反应的潜在风险，基于此，我们研发了全新的针对CD20的纳米抗体，以期进一步提高抗体的功能，降低HAMA反应的风险。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术所要解决的技术问题是提供一种针对CD20的纳米抗体，同时提供该纳米抗体的编码序列及该纳米抗体在制备检测的应用。技术方案：本专利技术的技术方案为：本专利技术的第一方面，提供了一种针对CD20重链抗体VHH，包括框架区FR和互补决定区CDR，所述框架区FR选自下组的FR的氨基酸序列：SEQIDNO：1所示的FR1，SEQIDNO：2所示的FR2，SEQIDNO：3所示的FR3，SEQIDNO：4所示的FR4。所述互补决定区CDR选自下组的CDR的氨基酸序列：SEQIDNO：5所示的CDR1，SEQIDNO：6所示的CDR2，SEQIDNO：7所示的CDR3。优选地，所述的CD20纳米抗体的VHH链，它具有SEQIDNO：8所示的氨基酸序列。本专利技术第二方面，一种针对CD20重链抗体VHH，此抗体特异性识别CD20抗原，包括一条具有SEQIDNO：8所示氨基酸序列的VHH链。本专利技术第三方面，提供了一种DNA分子，它编码选自下组的蛋白质：本专利技术所述的CD20重链抗体VHH。优选地，所述的DNA分子，其特征在于，它具有选自下组的DNA序列：SEQIDNO：9。有益效果：与现有技术相比，本专利技术的优点如下：本专利技术将血液中提取的CD20免疫新疆单峰驼，随后利用该骆驼外周血淋巴细胞建立了针对于CD20的纳米抗体基因库，试验中将CD20偶联在酶标板上，以此形式的抗原利用噬菌体展示技术筛选免疫性的纳米抗体基因库（骆驼重链抗体噬菌体展示基因库），从而获得了针对CD20特异性的纳米抗体基因，将此基因转至大肠杆菌中，从而建立了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株。附图说明图1是用噬菌体的酶联免疫方法（ELISA）筛选特异性单个阳性克隆的模式图；其中1是将CD20蛋白偶联在酶标板上，2是纳米抗体，3是鼠抗HA抗体，4是山羊抗小鼠碱性磷酸酶标记的抗体，5是碱性磷酸酶显色液。图2是表达的CD20纳米抗体，经镍柱树脂凝胶亲和层析纯化后的SDS-PAGE的电泳图；其中泳道1是蛋白分子标准，其余泳道是250毫摩尔咪唑洗脱液所洗脱下来的纳米抗体，结果显示CD20纳米抗体经过该纯化过程，其纯度可达到95%以上。图3是CD20纳米抗体在不同环境温度下的耐受性检测。具体实施方式本专利技术首先将CD20的可溶性蛋白作为抗原免疫一只新疆单峰驼，经过5次免疫之后提取该单峰驼外周血淋巴细胞并构建了CD20特异的单域重链抗体文库。将CD20偶联在NUNC酶标板上，展示蛋白质的正确空间结构，使得CD20的抗原表位得以暴露出来，以此形式的抗原利用噬菌体展示技术筛选CD20免疫性的纳米抗体基因库（骆驼重链抗体噬菌体展示基因库），而获得了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株。下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。实施例1针对于CD20的纳米抗体文库的构建：（1）首先合成抗原CD20，用于免疫所用的CD20的浓度为500μg/mL，每次免疫将0.5mgCD20与弗氏佐剂等体积混合，免疫一只新疆单峰驼(句容圣龙家畜养殖厂)，每周一次，共免疫5次，除第一次使用完全的弗氏佐剂（购自sigma），剩余几次全部使用弗式不全佐剂（购自sigma），免疫过程中刺激B细胞表达抗原特异性的纳米抗体。（2）5次免疫结束后，提取骆驼外周血淋巴细胞100mL并提取总RNA参照QIAGEN公司提供的RNA提取试剂盒。（3）按照Super-ScriptIIIFIRSTSTRANDSUPERMIX试剂盒说明书，将提取的RNA反转录成cDNA。用巢式PCR扩增重链抗体的可变区片段：第一轮PCR：上游引物：GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGGC下游引物：GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC扩增重链抗体引导肽和抗体CH2之间的片段，54℃退火，25个循环；结果显示该片段的大小约为700bp，即纳米抗体基因电泳带约为700bp。第二轮PCR：以第一轮PCR产物作模板，上游引物：GATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGRGGAGG下游引物：GGACTAGTGCGGCCGCTGGAGACGGTGACCTGGGT扩增重链抗体FR1区和长、短铰链区之间的片段（长片段和短片段），60℃退火，17个循环，回收目的片段，结果显示该片段的大小约为500bp，即纳米抗体基因电泳带约为500bp。（4）使用限制性的内切酶（购自NEB）PstI及NotI酶切20μgpComb3噬菌体展示载体（Biovector供应）及10μgVHH并用T4DNA连接酶（购自TaKaRa公司）连接两个片段。（5）将连接产物电转化至电转感受态细胞TG1（北京神州红叶科技有限公司）中，构建CD20的纳米抗体噬菌体展示文库并测定库容，库容的大小为3.1×108。与此同时，通过菌落PCR检测引物使用第二轮PCR引物，Tm55℃。文库构建完成后，为检测文库的插入率，随机选取24颗克隆做菌落PCR。结果显示插入率已达到90%以上。实施例2针对CD20的纳米抗体筛选过程：(1)将溶解在PBS中的100μg/mL的CD20包被在NUNC酶标板上，4℃放置过夜，同时设立负对照。(2)第二天两个孔本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.CD20纳米抗体的VHH链，包括框架区FR和互补决定区CDR，所述框架区FR选自下组的FR的氨基酸序列：SEQ ID NO：1所示的FR1，SEQ ID NO：2所示的FR2，SEQ ID NO：3所示的FR3，SEQ ID NO：4所示的FR4；所述互补决定区CDR选自下组的CDR的氨基酸序列：SEQ ID NO：5所示的CDR1，SEQ ID NO：6所示的CDR2，SEQ ID NO：7所示的CDR3。

【技术特征摘要】
1.CD20纳米抗体的VHH链，包括框架区FR和互补决定区CDR，所述框架区FR选自下组的FR的氨基酸序列：SEQIDNO：1所示的FR1，SEQIDNO：2所示的FR2，SEQIDNO：3所示的FR3，SEQIDNO：4所示的FR4；所述互补决定区CDR选自下组的CDR的氨基酸序列：SEQIDNO：5所示的CDR1，SEQIDNO：6所示的CDR2，SEQIDNO：7所示的CDR3。2.根据权利要求1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：劳英斌，张晴晴，焦力，姚紫娟，孙建飞，
申请(专利权)人：南京东极医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32