双行睫筛查试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及体外诊断试剂盒领域，尤其涉及一种双行睫的筛查试剂盒。本发明专利技术提供了一种与双行睫相关的生物标记物，它是在人类FOXC2基因序列的基础上，于编码区第936～937位碱基之间插入CGCCGCC序列所得到的DNA。本发明专利技术还提供了一种双行睫筛查试剂盒，它由扩增和检测前述DNA的试剂组成。本发明专利技术可以有效对双行睫进行筛查，应用前景良好。

Double line eyelash screening kit

【技术实现步骤摘要】
双行睫筛查试剂盒
本专利技术涉及体外诊断试剂盒领域，尤其涉及一种双行睫的筛查试剂盒。
技术介绍
双行睫为正睫毛根部后方相当于睑板腺开口处生长另一排多余的睫毛，也称副睫毛；可刺激结膜和角膜，并引起损伤。双行睫为先天性睫毛发育异常所致的。有些时候双行睫症状并不典型，眼科检查可能会漏掉这些不典型的病例。症状不典型可能不会影响患者本人的生活，但其后代有可能受到双行睫的困扰。此时往往需要体外分子诊断来辅助诊断。但目前市面上尚未出现针对双行睫的筛查试剂盒。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供了一种与双行睫相关的生物标记物，它是在人类FOXC2基因序列的基础上，于编码区第936-937位碱基(C.936-937)之间插入CGCCGCC序列所得到的DNA。本专利技术还提供了前述生物标记物的试剂在制备双行睫筛查试剂盒中的用途。本专利技术还提供了另一种与双行睫相关的生物标记物，它是由前述DNA经转录或翻译所得到的mRNA或蛋白。本专利技术还提供了前述生物标记物(mRNA或蛋白)的试剂在制备双行睫筛查试剂盒中的用途。本专利技术还提供了一种双行睫筛查试剂盒，它含有检测前述DNA的试剂。如前述的试剂盒，它还包括扩增前述DNA的试剂。如前述的试剂盒，所述检测前述DNA的试剂为测序试剂。如前述的试剂盒，所述检测前述DNA的试剂为荧光定量PCR试剂。如前述的试剂盒，所述检测前述DNA的试剂为限制性片段长度多态性方法用试剂。如前述的试剂盒，所述检测前述DNA的试剂为单链构象多态性分析用试剂。本专利技术具有如下有益效果：1)本专利技术提供了用于双行睫筛选的基因序列多态性位点，而该位点发生变化的DNA、mRNA以及蛋白均可作为双行睫筛选、早期干预与治疗的生物标记物，应用前景广大。2)本专利技术提供的试剂盒能够简单有效地筛选双行睫。显然，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过具体实施方式对本专利技术的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。附图说明图1：双行睫2263家系的家系图谱；斜杠表已故，实心圆或实心方形表患者，箭头指示先证者。图2：PCR产物直接测序检测C.936-937插入CGCCGCC碱基的突变序列图谱。图3：FOXC2基因在人胚胎组织(Placenta)、人肺组织(H-lung)、人肾脏上皮细胞(HEK293)、视网膜(Retain)中的表达检测图。具体实施方式实施例1样本收集和基因组DNA的提取家系及病例样本均来自由四川省医学科学院·四川省人民医院人类疾病基因研究四川省重点实验室承担的国家自然科学基因资金(课题号：81570888，81870683)收集的样本。双行睫家系(2263)成员共计5人，其中双行睫患者3人，家系图如图1所示。另一双行睫家系(2355)成员共计4人，其中双行睫患者2人，家系图如图2所示。所有受检者均为汉族，且签署知情同意书，这一研究也得到了伦理委员会的批准。每人采集EDTA抗凝外周血样5ml，盐析法提取基因组DNA，具体步骤为：将5mlEDTA抗凝血样于离心机3000rpm离心10min，用巴氏吸管吸取中间白细胞层中加了10ml红细胞裂解液(配方：将1gkHCO3、8.3gNH4Cl和0.037gEDTA-Na2用无菌水定容于1L、)的15ml离心管中，颠倒6-8次后，室温静置10min；室温3000rpm离心10min，去上清，漩涡振荡15秒；再加入4ml红细胞裂解液，漩涡振荡15秒，室温3000rpm离心10min，去上清，留下管底白细胞团；漩涡振荡30秒，充分分散白细胞团，加入4ml白细胞裂解液(配方：)和40ul蛋白酶K，漩涡振荡5秒，65℃水浴30-60min至白细胞团消失，漩涡振荡5秒；冷却至室温，加1.5ml饱和氯化钠溶液(配方：)，漩涡振荡15秒，室温3000rpm离心10min，转移上清至另一离心管；向上清液中加入4ml异丙醇，颠倒混匀10-15次，室温3000rpm离心15min，去上清；加2ml75％无水乙醇轻轻振荡，室温3000rpm离心15min，去上清后室温干燥1-2小时，加200ul的DEPC水溶解，-80℃保存。实施例2FOXC2基因C.936-937插入CGCCGCC碱基的突变位点检测一、检测方法1、提取双行睫2263家系成员的血液基因组DNA2、FOXC2基因C.936-937插入CGCCGCC碱基的突变位点检测(1)PCR扩增：以步骤1得到的基因组DNA为模板，以引物对A(上游引物(SEQIDNO.1)：AAGGTGGTGATCAAGAGCGA；下游引物(SEQIDNO.2)：GAGGTGGTTCAGGTCCCC)为引物，采用康为生产的2×PCRmix进行PCR扩增。体系：2×PCRmix10ul，上下游引物各1ul(10umol/ul)，模板DNA(25ng/ul)1ul，ddH2O7ul。程序：95℃预变性5分钟，95℃30秒，54℃退火30秒，72℃延伸45秒，35个循环；72℃延伸7分钟，12℃保温。扩增产物为如下序列(SEQIDNO.3，678bp)：(2)PCR产物纯化：取步骤(1)的PCR产物1.5ul，加入3.5ulThermo公司生产的Exco-SAP纯化酶。程序：37℃30分钟，80℃15分钟，12℃保温。(3)测序反应：以步骤(2)的产物为模板，以引物对A的上游引物(序列：AAGGTGGTGATCAAGAGCGA)为引物，用ABI公司的DNA片段测序试剂盒测序。反应体系：2ul纯化后的PCR产物，0.3ul5×buffer，0.3ul引物对A的上游引物(10umol/ul)，0.3ulBigdye，7.1ulddH2O。程序：96℃15秒，50℃10秒，60℃4分钟，29个循环，12℃保温。(4)测序反应产物纯化：每个反应加入50ul75％乙醇，4000转/分钟离心30分钟，去除上清，室温静置30分钟晾干乙醇，加入10ulddH2O，上机测序。(5)上机测序分析：采用ABI3730测序仪进行测序分析。二、检测结果FOXC2基因C.936-937插入CGCCGCC碱基突变的测序图如图2所示，根据测序图和双行睫2263家系成员基本情况绘制表1。表1双行睫2263家系成员基本情况及FOXC2基因测序结果双行睫2263家系成员共计5人，其中双行睫患者3人，图1为双行睫2263家系的家系图谱。由表1可知，双行睫2263家系成员中，双行睫患者均有FOXC2基因C.936-937插入CGCCGCC碱基突变，而FOXC2基因C.937的基因型为T/T，即未发生T/CGCCGCCT变异的成员未患有双行睫。实验证明，FOXC2基因C.937位是否发生T/CGCCGCCT变异与其患双行睫的风险更低紧密相关。实施例4FOXC2基因C.936-937insCGCCGCC、C.937-938insGCCGCCT基因型在非双行睫人群中的检测一、检测方法1、分别提取300名非双行睫患者的血液基因组DNA。2、突变检测同实施例2第一部分第2节。二、检测结果所检测的300名非双行睫患者FOXC2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种与双行睫相关的生物标记物，其特征在于：它是在人类FOXC2基因序列的基础上，于编码区第936‑937位碱基之间插入CGCCGCC序列所得到的DNA。

【技术特征摘要】
2019.05.29 CN 20191046140811.一种与双行睫相关的生物标记物，其特征在于：它是在人类FOXC2基因序列的基础上，于编码区第936-937位碱基之间插入CGCCGCC序列所得到的DNA。2.检测权利要求1所述生物标记物的试剂在制备双行睫筛查试剂盒中的用途。3.一种与双行睫相关的生物标记物，其特征在于：它是由权利要求1所述DNA经转录或翻译所得到的mRNA或蛋白。4.检测权利要求3所述生物标记物的试剂在制备双行睫筛查试剂盒中的用...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋灵晰，石毅，张剑波，龚波，罗冬燕，郑睿，王廷婷，
申请(专利权)人：电子科技大学附属医院·四川省人民医院，
类型：发明
国别省市：四川,51