本发明专利技术涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种植物乳杆菌生产透明质酸酶发酵优化工艺，工艺包括以下步骤：配制种子培养基；向种子培养基中接入植物乳杆菌，培养获得液体发酵菌种；配制液体发酵培养基；将液体发酵菌种接入液体发酵培养基中，培养后结束发酵；将发酵液离心后，收集上清液，即为粗酶液。本发明专利技术创造性地通过调整发酵培养转速、通气量，对菌体进行耐氧性驯化培养，使植物乳杆菌能在好氧条件下正常发酵生产透明质酸酶；通过条件优化，使植物乳杆菌代谢产物中透明质酸酶产量大幅提升：此生产工艺制得的发酵液所含透明质酸酶为9604IU/mL，比工艺优化前提高了40％，便于后续的分离纯化；本发明专利技术生产工艺简便、稳定性高、便于扩大规模生产和推广。
Optimization of hyaluronidase production by Lactobacillus plantarum
【技术实现步骤摘要】
一种植物乳杆菌生产透明质酸酶发酵优化工艺
本专利技术涉及微生物发酵
，具体涉及一种植物乳杆菌生产透明质酸酶发酵优化工艺。
技术介绍
透明质酸是构成宿主结缔组织细胞外基质的主要成分，而透明质酸酶(hyaluronidase，HAase)是能特异性分解细胞外基质成分——透明质酸(HA)使其产生低分子化作用的一种蛋白水解酶。透明质酸酶通过作用于细胞外基质而影响细胞的增殖、分化与迁移，并在胚胎发育和肿瘤发生发展过程中发挥作用，因此对有效控制病原菌感染、防止其扩散具有举足轻重的作用，对临床细菌感染性疾病的防治也具有重要意义。透明质酸酶虽然分布广，但在过去很长一段时间内由于分离纯化非常困难，没有得到很好的开发利用，是一类被忽视的酶。同时由于透明质酸酶的来源非常有限，价格昂贵，很大程度上也限制了它的应用范围。直到近十几年，研究者才开始对HA和HAase表现出浓厚的兴趣，试图探求其在众多生物学过程中的作用。研究发现透明质酸酶可通过降解组织中的HA，增加膜的通透性，降低黏度，促进注射液的扩散，这些现象称为透明质酸酶的扩散作用。基于这一性质，透明质酸酶可应用于治疗过程，以加快吸收速度，促进注射液吸收，提高局麻效果，并防止皮下及肌肉注射后对组织的破坏。随着人们对HA、低分子HA和HA寡糖生物学意义及其重要性认识的不断深入，越来越多的证据表明，低相对分子质量HA和HA寡糖的生物活性与HA显著不同。基于此，提供一种可发酵生产透明质酸酶的菌种及能够使酶活性明显提高的发酵工艺方法具有非常重要的意义。
技术实现思路
针对现有技术可发酵生产透明质酸酶的菌种少且酶活性较低的问题，本专利技术提供一种植物乳杆菌生产透明质酸酶发酵优化工艺，该工艺通过改善培养基组成与培养条件，提高透明质酸酶产量，并使酶活提高40％。一种植物乳杆菌生产透明质酸酶发酵优化工艺，工艺包括以下步骤：S1：配制种子培养基，所述种子培养基包括诱导剂、氮源、无机盐和表面活性剂，所述诱导剂同时可作为碳源利用，为5g/L分子量1000kDa-2000kDa的透明质酸，所述氮源为复合氮源，包括5g/L蛋白胨、10g/L酵母粉、1.5g/L硫酸铵，所述无机盐包括0.1g/L氯化钠、0.1g/L硫酸亚铁、0.03g/L硫酸锰、0.04g/L氯化钙、0.25g/L硫酸镁，所述表面活性剂为1mL/L吐温-80或0.05g/L乙二胺四乙酸二钠；S2：向种子培养基中接入植物乳杆菌，培养获得液体发酵菌种；S3：配制液体发酵培养基，所述液体发酵培养基包括诱导剂、氮源、无机盐和表面活性剂，所述诱导剂同时可作为碳源利用，为1-10g/L分子量500KDa-1300kDa的透明质酸，所述氮源为复合氮源，包括5g/L蛋白胨、10g/L酵母粉、2g/L硫酸铵，所述无机盐包括0.1g/L氯化钠、0.1g/L硫酸亚铁、0.02g/L硫酸锰、0.05g/L氯化钙、0.2g/L硫酸镁、0.4g/L磷酸二氢钾，所述表面活性剂为0.5mL/L-1.5mL/L吐温-80或0.01g/L-0.08g/L乙二胺四乙酸二钠；S4：将液体发酵菌种接入液体发酵培养基中，培养后结束发酵；S5：将发酵液离心后，收集上清液，即为粗酶液。进一步的，所述植物乳杆菌为植物乳杆菌CnT012-56，该菌株的分类命名为植物乳杆菌Lactobacillusplantarum，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏时间为2018年11月28日，保藏编号为CGMCCNO.16836。进一步的，所述S1中，采用500mL三角瓶装200mL种子培养基。进一步的，所述S2中，菌种最适培养条件为pH6.0、转速50rpm、培养温度35℃、培养时间18-24h。进一步的，所述S3中，采用5L发酵罐装4L液体发酵培养基。进一步的，所述S3中，液体发酵培养基中诱导剂为5-8g/L分子量500KDa-1300kDa的透明质酸。进一步的，所述S3中，液体发酵培养基中表面活性剂为1mL/L吐温-80或0.05g/L乙二胺四乙酸二钠。进一步的，所述S4中，菌种最适培养条件为pH5.0-8.0、培养温度30℃-38℃、培养48h，对转速及通气量进行分阶段调节：0-20h，转速50rpm、通气量2L/min，20-30h，转速100rpm、通气量4L/min30-48h，转速200rpm、通气量8L/min。进一步的，所述S4中，菌种最适培养条件优选为pH5.5、培养温度35℃。进一步的，所述S4中，接种量为1％(v/v)-10％(v/v)，优选为5％(v/v)。本专利技术提供一种植物乳杆菌生产透明质酸酶发酵优化工艺，其有益效果在于，(1)创造性地通过调整发酵培养转速、通气量，对菌体进行耐氧性驯化培养，使植物乳杆菌CnT012-56能在好氧条件下正常发酵生产透明质酸酶；(2)通过条件优化，使植物乳杆菌代谢产物中透明质酸酶产量大幅提升：此生产工艺制得的发酵液所含透明质酸酶为9604IU/mL，比工艺优化前提高了40％，便于后续的分离纯化；(3)本专利技术生产工艺简便、稳定性高、便于扩大规模生产和推广。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为筛选例1中5g/L不同碳源对种子培养的影响折线图；图2为筛选例1中不同透明质酸浓度对种子培养的影响折线图；图3为筛选例1中不同吐温-80浓度对种子培养的影响折线图；图4为筛选例1中不同乙二胺四乙酸二钠浓度对种子培养的影响折线图；图5为筛选例1中不同种龄对种子培养及HAase发酵生产的影响折线图；图6为筛选例2中不同诱变剂/碳源对HAase发酵生产的影响柱状图。图中OD600为菌液在紫外分光光度计600nm检测的吸收值，用于反映培养基中菌体浓度。具体实施方式为了使本
的人员更好地理解本专利技术中的技术方案，下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本专利技术保护的范围。本专利技术所涉及到的透明质酸酶酶活定义与酶活检测方法，参考《中国药典》(2015版附录1207)《玻璃酸酶测定法》。筛选例1种子培养基组分及菌种培养条件的确定在种子初始培养基的基础上，以35℃，pH6.00，50rpm培养24小时为基础培养条件，利用单因素优化策略，进行菌种培养条件优化实验，通过添加诱导剂、碳源、氮源、无机盐确定最佳菌种培养基配方，通过调节pH、培养温度、转速、种龄确定最佳培养条件。种子初始培养基：10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉、5g/L透明质酸(分子量1000kDa-2000kDa)、3g/L葡萄糖、0.1g/L氯化钠、2g/L硫酸铵、0.05g/L硫酸亚铁、0.2g/L硫酸镁、1mL/L吐温-80。(1)诱导剂/碳源的确定在种子初始培养基的基础上，利用单因素优化策略，进行诱导剂/碳源优化，选取不同的碳源和不同浓度的诱导本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种植物乳杆菌生产透明质酸酶发酵优化工艺，其特征在于，工艺包括以下步骤：S1：配制种子培养基，所述种子培养基包括诱导剂、氮源、无机盐和表面活性剂，所述诱导剂同时可作为碳源利用，为5g/L分子量1000kDa‑2000kDa的透明质酸，所述氮源为复合氮源，包括5g/L蛋白胨、10g/L酵母粉、1.5g/L硫酸铵，所述无机盐包括0.1g/L氯化钠、0.1g/L硫酸亚铁、0.03g/L硫酸锰、0.04g/L氯化钙、0.25g/L硫酸镁，所述表面活性剂为1mL/L吐温‑80或0.05g/L乙二胺四乙酸二钠；S2：向种子培养基中接入植物乳杆菌，培养获得液体发酵菌种；S3：配制液体发酵培养基，所述液体发酵培养基包括诱导剂、氮源、无机盐和表面活性剂，所述诱导剂同时作为碳源利用，为1‑10g/L分子量500KDa‑1300kDa的透明质酸，所述氮源为复合氮源，包括5g/L蛋白胨、10g/L酵母粉、2g/L硫酸铵，所述无机盐包括0.1g/L氯化钠、0.1g/L硫酸亚铁、0.02g/L硫酸锰、0.05g/L氯化钙、0.2g/L硫酸镁、0.4g/L磷酸二氢钾，所述表面活性剂为0.5mL/L‑1.5mL/L吐温‑80或0.01g/L‑0.08g/L乙二胺四乙酸二钠；S4：将液体发酵菌种接入液体发酵培养基中，培养后结束发酵；S5：将发酵液离心后，收集上清液，即为粗酶液。...
【技术特征摘要】
1.一种植物乳杆菌生产透明质酸酶发酵优化工艺，其特征在于，工艺包括以下步骤：S1：配制种子培养基，所述种子培养基包括诱导剂、氮源、无机盐和表面活性剂，所述诱导剂同时可作为碳源利用，为5g/L分子量1000kDa-2000kDa的透明质酸，所述氮源为复合氮源，包括5g/L蛋白胨、10g/L酵母粉、1.5g/L硫酸铵，所述无机盐包括0.1g/L氯化钠、0.1g/L硫酸亚铁、0.03g/L硫酸锰、0.04g/L氯化钙、0.25g/L硫酸镁，所述表面活性剂为1mL/L吐温-80或0.05g/L乙二胺四乙酸二钠；S2：向种子培养基中接入植物乳杆菌，培养获得液体发酵菌种；S3：配制液体发酵培养基，所述液体发酵培养基包括诱导剂、氮源、无机盐和表面活性剂，所述诱导剂同时作为碳源利用，为1-10g/L分子量500KDa-1300kDa的透明质酸，所述氮源为复合氮源，包括5g/L蛋白胨、10g/L酵母粉、2g/L硫酸铵，所述无机盐包括0.1g/L氯化钠、0.1g/L硫酸亚铁、0.02g/L硫酸锰、0.05g/L氯化钙、0.2g/L硫酸镁、0.4g/L磷酸二氢钾，所述表面活性剂为0.5mL/L-1.5mL/L吐温-80或0.01g/L-0.08g/L乙二胺四乙酸二钠；S4：将液体发酵菌种接入液体发酵培养基中，培养后结束发酵；S5：将发酵液离心后，收集上清液，即为粗酶液。2.如权利要求1所述的一种植物乳杆菌生产透明质酸酶发酵优化工艺，其特征在于，所述植物乳杆菌为植物乳杆菌CnT012-56，该菌株的分类命名为植物乳杆菌Lactobacillusplantarum，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号...
【专利技术属性】
技术研发人员：高瑞，韩鹏，韩秀云，齐宁，牛贵清，张彬，赵艳辉，郭弘彦，梁贵彬，王娜，刘文彬，
申请(专利权)人：山东安华生物医药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37
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