一种梨果实液泡酸性转化酶及其活性抑制因子的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种梨果实液泡酸性转化酶及其活性抑制因子的应用，该梨果实液泡酸性转化酶PbrAc‑Inv1具有如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的蛋白质；所述梨液泡酸性转化酶PbrAc‑Inv1的活性抑制因子具有如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的蛋白质；本发明专利技术的PbrAc‑Inv1具有液泡酸性转化酶活性，转入植物或微生物中，可提高其对蔗糖利用效率，从而提高产量。本发明专利技术的PbrII5具有液泡酸性转化酶活性抑制因子功能，转入植物或微生物中可抑制蔗糖的转化利用。

Application of acid invertase and its activity inhibitor in vacuole of pear fruit

【技术实现步骤摘要】
一种梨果实液泡酸性转化酶及其活性抑制因子的应用
本专利技术涉及一种梨果实液泡酸性转化酶及其活性抑制因子的应用。
技术介绍
转化酶(invertase,INV)是一种水解酶，不可逆地催化蔗糖转化为果糖和葡萄糖，其不仅在初级碳代谢中发挥功能，还广泛参与植物生长发育的多个调节过程。根据最适pH的差异，转化酶可分为酸性转化酶和中性/碱性转化酶两大类。其中，酸性转化酶又可分为细胞壁转化酶(cellwallinvertase,CWI)和液泡转化酶(vacuolarinvertase,VI)，最适pH分别为4.5-5.0和5.0-6.5。中性/碱性转化酶为细胞质转化酶(cytoplasmicinvertase,CI)，最适pH为7.0-7.8[1]。甜度是果实风味品质的重要组成部分，其主要取决于果实中糖分的组成和含量。VI在植物生长、繁殖、抗逆和风味品质形成过程中都起着重要的作用。Roitsch等人(2004)研究证实VI可调控果实中糖的含量和比例，从而能够控制果实的甜味[2]。在烟草中过表达枇杷VI基因后，VI活性显著上升，而蔗糖含量明显下降[3]。VI的活性受液泡转化酶抑制因子(vacuolarinvertaseinhibitor,VII)的调节，在过表达番茄中的液泡转化酶抑制因子(VII)后，VI活性显著下降，且蔗糖含量是对照组的10倍，而在VII基因被沉默的植株中VI活性提升，蔗糖含量也随之降低[4]。梨是一种重要的落叶果树，在全球范围内广泛种植。但梨果实液泡酸性转化酶及其活性抑制因子的研究未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种梨果实液泡酸性转化酶。本专利技术的另一目的在于提供上述梨果实液泡酸性转化酶的活性抑制因子。本专利技术的又一目的在于提供上述梨果实液泡酸性转化酶及其活性抑制因子的应用。本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：一种梨果实液泡酸性转化酶PbrAc-Inv1，是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)具有如SEQIDNO.1所示氨基酸序列的蛋白质；序列表中的SEQIDNO.1由645个氨基酸残基组成。(b)将SEQIDNO.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有蔗糖转化酶功能的由(a)衍生的蛋白质。本专利技术所提供的液泡酸性转化酶来源于蔷薇科梨属的‘丰水’梨(‘Housui’)，名称为PbrAc-Inv1。上述的液泡酸性转化酶(PbrAc-Inv1)的活性抑制因子也属于本专利技术保护的范围，名称为PbrII5，该活性抑制因子是如下1)或2)的蛋白质：1)具有如SEQIDNO.2所示氨基酸序列的蛋白质；序列表中的SEQIDNO.2由184个氨基酸残基组成。2)将SEQIDNO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有蔗糖转化酶活性抑制剂功能的由1)衍生的蛋白质。上述一个或数几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。所述液泡酸性转化酶(PbrAc-Inv1)及其活性抑制因子(PbrII5)的编码基因也属于本专利技术的保护范围。所述梨果实液泡酸性转化酶PbrAc-Inv1的编码基因，具有如SEQIDNO.3所示核苷酸序列。序列表中的SEQIDNO.3由4209个核苷酸组成。所述活性抑制因子的编码基因，具有如SEQIDNO.4所示核苷酸序列。序列表中的SEQIDNO.4由555个核苷酸组成。含有上述液泡酸性转化酶(PbrAc-Inv1)或/和其活性抑制因子的编码基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本专利技术的保护范围。上述的梨果实液泡酸性转化酶PbrAc-Inv1和/或上述的活性抑制因子在调节果树果实糖含量或/和果实风味中的应用。所述的果树优选为梨，但不限于此。一种梨果实的转基因育种方法，以上述液泡酸性转化酶(PbrAc-Inv1)或/和其活性抑制因子的编码基因作为靶基因，通过调控两者的表达调节梨果实的糖含量或/和果实风味。本专利技术的有益效果：本专利技术的PbrAc-Inv1具有液泡酸性转化酶活性，转入植物或微生物中，可提高其对蔗糖利用效率，从而提高产量。本专利技术的PbrII5具有液泡酸性转化酶活性抑制因子功能，转入植物或微生物中可抑制蔗糖的转化利用。附图说明图1梨果实贮藏期间糖含量变化图。图2梨果实贮藏期间液泡酸性转化酶(VI)活性变化。图3梨果实贮藏期间13个VI基因表达量热图。图4PbrAc-Inv1/4与其他物种的VI氨基酸序列比对。图5PbrAc-Inv1/4与其他物种的VI基因系统进化分析。图6PbrAc-Inv1的亚细胞定位。图7瞬时表达PbrAc-Inv1后其基因表达量变化。图8瞬时表达PbrAc-Inv1后VI活性变化。图9瞬时表达PbrAc-Inv1后果糖、山梨醇、葡萄糖和蔗糖与对照组含量的比值。图10瞬时表达PbrAc-Inv1后对梨果实风味的影响。图11梨果实贮藏期间9个液泡酸性转化酶抑制因子(VII)基因表达量热图。图12梨果实贮藏期间PbrAc-Inv1/4和PbrII5表达量变化图。图13PbrII5与其他物种的VII基因系统进化分析。图14PbrII5与其他物种的VII氨基酸序列比对。图15PbrII5的亚细胞定位。图16瞬时表达PbrII5后其基因表达量变化。图17瞬时表达PbrII5后VI活性变化图18瞬时表达PbrII5后果糖、山梨醇、葡萄糖和蔗糖与对照组含量的比值.图19瞬时表达PbrII5后对梨果实风味的影响。图20体外实验中PbrII5对VI酶活性的影响。图21酵母双杂交实验验证PbrII5与PbrAc-Inv1互作。图22双荧光素酶实验验证PbrII5与PbrAc-Inv1互作。图23生物膜层干涉技术验证PbrII5与PbrAc-Inv1互作。具体实施方式下述实施例中所述的方法，若无特别说明，均为常规方法。实施液泡酸性转化酶及其酶活性抑制因子的筛选和鉴定，并进行功能验证及互作验证。我们首次鉴定了梨果实液泡酸性转化酶基因(VI)及其活性抑制因子(VII)，进行了序列及表达分析，并进行了功能研究。1.VI的筛选与鉴定对‘丰水’梨不同贮藏时期样品进行转录组测序、糖含量和VI活性测定，结合转录组注释、相关性分析、生物信息学分析和亚细胞定位分析，筛选出关键VI基因。进一步通过梨果实中的过表达，对筛选出的关键基因进行功能验证。具体实施方法如下：<1>关键VI的筛选在南京农业大学梨种质资源圃中采集长势相近、无明显机械伤的‘丰水’梨，随机分组后套袋，贮藏于25℃条件下，每6天进行一次取样，直至腐烂率超过20％。果糖、山梨醇、葡萄糖、蔗糖四种糖的提取和测定参考Wang等人[5]的方法，使用美国沃特斯公司生产的超高效液相色谱仪(UPLC)进行含量测定，流动相为1％(v/v)乙腈：超纯水＝85:15(v:v)，流速为0.2mLmin-1，30℃。结果表明，在梨果实贮藏过程中，总还原糖含量稳定积累，其中，果糖和葡萄糖稳定累积，而蔗糖和山梨醇趋势相反(图1)。VI活性测定使用苏州科铭生物技术有限公司生产的可溶性酸性转化酶(S-AI)测试盒(货号SAI-1-Y)进行。结果表明，在贮藏过程的0至18天，VI活性逐渐上升，但在贮藏最后阶段下降(图2)。使用In本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种梨果实液泡酸性转化酶PbrAc‑Inv1，其特征在于，该梨果实液泡酸性转化酶PbrAc‑Inv1是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)具有如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的蛋白质；(b)将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有蔗糖转化酶功能的由(a)衍生的蛋白质。

【技术特征摘要】
1.一种梨果实液泡酸性转化酶PbrAc-Inv1，其特征在于，该梨果实液泡酸性转化酶PbrAc-Inv1是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)具有如SEQIDNO.1所示氨基酸序列的蛋白质；(b)将SEQIDNO.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有蔗糖转化酶功能的由(a)衍生的蛋白质。2.权利要求1所述梨果实液泡酸性转化酶PbrAc-Inv1的活性抑制因子，其特征在于，该活性抑制因子是如下1)或2)的蛋白质：1)具有如SEQIDNO.2所示氨基酸序列的蛋白质；2)将SEQIDNO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有蔗糖转化酶活性抑制剂功...

【专利技术属性】
技术研发人员：张绍铃，张臻，王利斌，马敏，张苏玲，郭霖，李健，张颜茹，樊进补，刘志强，贾璐婷，许林林，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32