本发明专利技术公开了一种产麦芽六糖能力提高的直链麦芽低聚糖生成酶突变体，属于酶工程技术领域。本发明专利技术的直链麦芽低聚糖生成酶突变体，以5％(w/w)玉米淀粉溶液为底物，产物中麦芽六糖的百分含量分别为36.10％(G109N)、42.40％、(G109D)及38.99％(G109F)，是野生型(32.93％)的1.10、1.29、1.18倍，且底物转化率均提高到79％以上。即使在较高的底物浓度下(玉米淀粉20％，w/w)，突变体G109D依然可以有效水解淀粉生产高浓度麦芽六糖，产物中麦芽六糖的百分含量为44.69％，高产物纯度及底物转化率可以有效降低高纯度直链麦芽低聚糖浆的生产加工成本，更具有工业应用价值。
A Straight-Chain Maltose Oligosaccharide Generating Enzyme Mutant with Enhanced Maltose Hexasaccharide Production Ability
【技术实现步骤摘要】
一种产麦芽六糖能力提高的直链麦芽低聚糖生成酶突变体
本专利技术涉及一种产麦芽六糖能力提高的直链麦芽低聚糖生成酶突变体，属于基因工程和酶工程
技术介绍
直链麦芽低聚糖是一类由3～10个α-D-吡喃葡萄糖单元以α-1,4-糖苷键连接而成的链状寡糖聚合体，是一类集营养和功能于一体的新糖源，它具有良好的食品加工特性和独特的生理功效，在食品、医药和精细化工等领域具有广泛的应用前景。其中直链麦芽低聚六糖参与构建的胆固醇和细菌响应性脂质复合物——智能纳米脂质体平台MLP18，可精确递送光敏剂红紫素18，对细菌感染部位进行细菌特异性标记和可视化声动力治疗，能有效消除多药耐药细菌对人体的威胁。此外直链麦芽六糖的衍生物可排除血清和尿液中的唾液α-淀粉酶和胰腺α-淀粉酶等干扰因子，在新型医疗临床用诊断试剂盒的开发研究中意义重大。目前工业上主要依靠直链麦芽低聚糖生成酶生产一种或几种麦芽低聚糖混合物，大多数报道的直链麦芽低聚糖酶存在产物特异性不佳、产物中麦芽六糖的含量过低、底物转化率低等问题。产物中麦芽六糖的含量过低会导致生产成本过高，且后续分离提纯困难，底物转化率低则未能使底物得到充分利用，生产效率低下，进一步提高生产成本与能耗，这些问题的存在使得直链麦芽低聚糖酶难以满足工业上的需求。寻找及筛选可适应工业化生产的直链麦芽低聚糖生成酶的过程十分费时，因此采用定点突变提高其酶学性质与产物特异性成为了更加便捷有效的手段。
技术实现思路
为了解决上述存在的技术问题，本专利技术通过对来源于BacillusstearothermophilusSTB04的直链麦芽低聚糖生成酶进行突变得到产麦芽六糖能力提高的直链麦芽低聚糖生成酶突变体G109N、G109D、G109F，其催化得到的产物中麦芽六糖的百分含量分别达到36.10％、42.40％及38.99％，且底物转化率均提高到79％以上，更能适应工业化生产。本专利技术的第一个目的是提供一种产麦芽六糖能力提高的直链麦芽低聚糖生成酶突变体，所述突变体的氨基酸序列包括：在SEQIDNO:1所示的氨基酸序列的基础上，将第109位的氨基酸进行突变后得到的氨基酸序列。在本专利技术的一种实施方式中，所述编码SEQIDNO:1所示的氨基酸序列的核苷酸序列是SEQIDNO:2所示的序列。在本专利技术的一种实施方式中，所述直链麦芽低聚糖生成酶为来源于BacillusstearothermophilusSTB04的直链麦芽低聚糖生成酶。在本专利技术的一种实施方式中，所述将第109位的氨基酸进行突变，是突变成天冬酰胺、天冬氨酸或苯丙氨酸。在本专利技术的一种实施方式中，所述直链麦芽低聚糖生成酶突变体的氨基酸序列分别为SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5。本专利技术的第二个目的是提供编码所述突变体的基因。本专利技术的第三个目的是提供携带所述基因的载体或细胞。本专利技术的第四个目的是提供表达所述突变体的基因工程菌。在本专利技术的一种实施方式中，所述的基因工程菌以枯草芽孢杆菌为宿主。在本专利技术的一种实施方式中，所述的基因工程菌以BacillussubtilisWB600为宿主。在本专利技术的一种实施方式中，所述的基因工程菌以pST为表达载体。本专利技术的第五个目的是提供一种制备直链麦芽六糖的方法，所述方法是以所述突变体或含有所述突变体的全细胞为催化剂，以淀粉为底物制备直链麦芽六糖。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法是以pH6.0的5～20％(w/w)玉米淀粉溶液为底物，以5～10U/g干基淀粉的加酶量加入所述直链麦芽低聚糖生成酶突变体，在pH6.0、60℃条件下反应24～72小时。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法是以pH6.0的5％(w/w)玉米淀粉溶液为底物，以5U/g干基淀粉的加酶量加入所述直链麦芽低聚糖生成酶突变体，在pH6.0、60℃条件下反应48小时。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法是以pH6.0的20％(w/w)玉米淀粉溶液为底物，以10U/g干基淀粉的加酶量加入所述直链麦芽低聚糖生成酶突变体，在pH6.0、60℃条件下反应24～72小时。本专利技术还提供所述的突变体或所述的基因工程菌在医药生产、化工或食品领域的应用。本专利技术的有益效果：(1)以5％(w/w)玉米淀粉为底物，直链麦芽低聚糖生成酶突变体G109N、G109D和G109F水解玉米淀粉的产物中麦芽六糖的百分含量分别可达到36.10％、42.40％、38.99％，分别是野生型(32.93％)的1.10、1.29、1.18倍。其中G109D的麦芽六糖产量最高，达到16.94g·L-1，相比野生型(麦芽六糖产量为12.41g·L-1)提高了36.5％，且底物转化率均提高到79％以上。(2)与野生型直链麦芽低聚糖生成酶相比，本专利技术所得的直链麦芽低聚糖生成酶突变体G109D在较高的底物浓度下(玉米淀粉20％，w/w)，依然可以有效水解淀粉生产高浓度麦芽六糖，产物中麦芽六糖的百分含量高达44.69％。高产物纯度及底物转化率可以有效降低高纯度直链麦芽低聚糖浆的生产加工成本，更具有工业应用价值。(3)本专利技术所提供的生产直链麦芽六糖糖浆的方法，和其他生产淀粉糖的方法相比，不需要在生产过程中调节温度和pH，不需要添加钙离子，不需要加入普鲁兰酶、异淀粉酶等其他协同酶制剂，因此工艺更为简单、便捷，生产成本更低。生物材料本专利技术的菌株BacillusstearothermophilusSTB04和质粒pST、pST/mfa均在潘思惠的文献《直链麦芽低聚糖生成酶在枯草芽孢杆菌中的分泌表达、酶学性质与产物研究》中公开(具体参见第二章2.1.1小节)，公开日：2018-06-30。附图说明图1：野生型及突变体直链麦芽低聚糖生成酶作用于5％(w/w)玉米淀粉的产物分析；G1～G7分别代表葡萄糖、麦芽糖、直链麦芽三糖、直链麦芽四糖、直链麦芽五糖、直链麦芽六糖、直链麦芽七糖。具体实施方式直链麦芽低聚糖生成酶活力的测定方法：酶活力的测定采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法。以C6H8O7-Na2HPO4缓冲液(10mM，pH5.5)配制1％(w/v)可溶性淀粉溶液作为底物，在0.9mL底物中加入100μL适当稀释后的酶液，60℃下反应15min，加入1.0mLDNS溶液终止反应，沸水浴中显色5min后立即冰浴冷却。加入2mL去离子水振荡均匀，于540nm下测定吸光值，根据葡萄糖标准曲线计算出体系中还原糖含量。以每分钟生成1μmol还原糖(以葡萄糖计)所需的酶量定义为1个酶活单位(U)。利用高效阴离子交换色谱(HPAEC-PAD)分析产物中各组分含量。分析条件为：采用CarboPacPA200色谱柱，以0.25MNaOH、1MNaAc和超纯水为流动相，设置流速为0.5mL/min，柱温35℃，进样量10μL。底物总转化率与各单糖组分在G1～G7中所占百分比的计算方法如下：单糖百分含量＝(单糖组分质量/G1～G7总质量)×100％总转化率＝(G1～G7总质量/底物干基质量)×100％实施例1：直链麦芽低聚糖生成酶突变体基因序列的制备(1)将氨基酸序列如SEQIDNO.1所示(核苷酸序列如SEQIDNO.2所示)的直链麦芽低聚糖生成酶基因连接到载体pST上，得到重组载体pST/mfa，具体构建过程参见文献《直链麦本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种产麦芽六糖能力提高的直链麦芽低聚糖生成酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列包括：在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的基础上，将第109位的氨基酸进行突变后得到的氨基酸序列。
【技术特征摘要】
1.一种产麦芽六糖能力提高的直链麦芽低聚糖生成酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列包括：在SEQIDNO:1所示的氨基酸序列的基础上，将第109位的氨基酸进行突变后得到的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的直链麦芽低聚糖生成酶突变体，其特征在于，所述编码SEQIDNO:1所示的氨基酸序列的核苷酸序列是SEQIDNO:2所示的序列。3.根据权利要求1所述的直链麦芽低聚糖生成酶突变体，其特征在于，所述将第109位的氨基酸进行突变，是突变成天冬酰胺、天冬氨酸或苯丙氨酸。4.编码权利要求1～3任一所述突变体...
【专利技术属性】
技术研发人员：李兆丰，谢小芳，顾正彪，李才明，洪雁，程力，班宵逢，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。