α-淀粉酶变体制造技术

本发明专利技术涉及亲本α‑淀粉酶的变体，当与亲本α‑淀粉酶相比时，该亲本α‑淀粉酶的变体具有改进的洗涤性能。本发明专利技术还涉及编码所述变体的多核苷酸，包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及产生本发明专利技术的变体的方法。

\u03b1 - amylase variant

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】α-淀粉酶变体序列表的引用本申请包含处于计算机可读形式的序列表，将其通过引用并入本文。专利技术背景
本专利技术涉及α-淀粉酶的变体、编码这些变体的多核苷酸和产生这些变体的方法。
技术介绍
α-淀粉酶(α-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，E.C.3.2.1.1)由一组酶构成，这些酶催化淀粉以及其他直链和支链1,4-糖苷寡糖和多糖的水解。α-淀粉酶在工业上用于若干种已知应用的用途具有悠久历史，这些应用如洗涤剂、烘焙、酿造、淀粉液化和糖化，例如在高果糖糖浆的制备中或用作从淀粉生产乙醇的一部分。α-淀粉酶的这些应用和其他应用是已知的并且利用了衍生自微生物的α-淀粉酶，特别是细菌α-淀粉酶。属于首先被使用的细菌α-淀粉酶是来自地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)的α-淀粉酶，还称作Termamyl，该Termamyl已经被充分表征并且这种酶的晶体结构已经被确定。碱性淀粉酶(如AA560)形成已经发现用于洗涤剂中的一个特定组的α-淀粉酶。这些已知的细菌淀粉酶中许多已经经修饰以改善它们在特定应用中的功能性。芽孢杆菌属淀粉酶，如Termamyl、AA560(WO2000/060060)和SP707(由Tsukamoto等人,1988,Biochem.Biophys.Res.Comm.[生物化学和生物物理研究通讯]151:25-31描述)形成已经发现用于洗涤剂中的一个特定组的α-淀粉酶。已经对这些淀粉酶进行修饰以改进其在洗涤剂中的稳定性。例如WO96/23873披露了缺失SP707(WO96/23873的SEQIDNO:7)的氨基酸181+182或氨基酸183+184以改进此淀粉酶的稳定性。WO96/23873进一步披露了通过用例如亮氨酸取代M202来修饰SP707淀粉酶以使该分子对氧化保持稳定。因而，修饰淀粉酶来改进某些特性是已知的。出于环境原因，在洗涤、餐具洗涤和/或清洁过程中降低温度已经日益重要。然而，大多数酶(包括淀粉酶)具有在低温洗涤中通常所用的温度以上的最适温度。α-淀粉酶是用于洗涤剂组合物中的关键酶并且对于衣物洗涤或餐具洗涤期间去除淀粉污渍，其用途已经变得日益重要。因此，重要的是找到如下α-淀粉酶变体，它们在温度降低时保留其洗涤性能、污渍去除作用和/或活性。然而，尽管当前洗涤剂酶组合物的效率，仍然存在着难以完全去除的许多污渍。这些问题因低(例如，冷水)洗涤温度的增加使用和较短的洗涤周期而加剧。因而，需要获得这样的淀粉分解酶，这些酶可以在低温下发挥功能并同时保留或增加其他所希望的特性如比活性(淀粉分解活性)、稳定性和/或洗涤性能。因此，本专利技术的一个目的是提供可在低温如在5℃-40℃用于洗涤、餐具洗涤和/或清洁过程中的α-淀粉酶变体。本专利技术的另一个目的是提供与亲本α-淀粉酶相比或与SEQIDNO:1、2、3、4、5、6、7或8中任一项的α-淀粉酶相比在低温具有改进的洗涤性能的α-淀粉酶变体。
技术实现思路
本专利技术涉及亲本α-淀粉酶的变体，其中该变体包含(i)在对应于SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列的109、1、7、280、284、320、323和391的一个或多个位置处的修饰，以及任选地在对应于SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列的位置140、181、182、183、184、195、206、243、260、304和476的一个或多个位置中的修饰，(ii)该变体与SEQIDNO:1、2、3、4、5、6、7或8中所示的氨基酸序列具有至少80％，如至少90％、如至少95％、如至少97％，但小于100％的序列同一性，并且(iii)该变体具有α-淀粉酶活性。本专利技术还涉及编码根据本专利技术的变体的多核苷酸、包含编码根据本专利技术的变体的多核苷酸的核酸构建体、包含编码根据本专利技术的变体的多核苷酸的表达载体、和包含编码根据本专利技术的变体的多核苷酸的宿主细胞。本专利技术还涉及产生α-淀粉酶变体的方法，该方法包括：(a)在适合于该变体表达的条件下培养本专利技术的宿主细胞；和(b)回收该变体。本专利技术进一步涉及获得α-淀粉酶变体的方法，该方法包括：在对应于SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列的109、7、1、391、280、284、320和323的一个或多个位置处，以及任选地在对应于SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列的位置140、181、182、183、184、195、206、243、260、304和476的一个或多个位置中向亲本α-淀粉酶引入修饰，其中各修饰独立地为取代或缺失，且该变体具有α-淀粉酶活性；以及回收该变体。具体实施方式本专利技术涉及亲本α-淀粉酶的变体，其中该变体包含(i)在对应于SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列的109、7、1、391、280、284、320和323的一个或多个位置处的修饰，以及任选地在对应于SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列的位置140、181、182、183、184、195、206、243、260、304和476的一个或多个位置中的修饰，(ii)该变体与SEQIDNO:1、2、3、4、5、6、7或8中所示的氨基酸序列具有至少80％，如至少90％、如至少95％、如至少97％，但小于100％的序列同一性，并且(iii)该变体具有α-淀粉酶活性。在一方面，本专利技术涉及亲本α-淀粉酶的变体，其中该变体包含(i)在对应于选自下组的位置的一个或多个位置处的修饰，该组由以下组成：SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列的109、1、7、280、284、320、323和391，以及任选地在对应于选自下组的位置的一个或多个位置中的修饰，该组由以下组成：SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列的140、181、182、183、184、195、206、243、260、304和476，(ii)该变体与SEQIDNO:1、2、3、4、5、6、7或8中所示的氨基酸序列具有至少80％，如至少90％、如至少95％、如至少97％，但小于100％的序列同一性，并且(iii)该变体具有α-淀粉酶活性。定义等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占据同一染色体基因座的基因的两种或更多种替代形式中的任一种。等位基因变异通过突变而自然产生，并且可以导致群体内部的多态性。基因突变可以是沉默的(所编码的多肽无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。术语“α-淀粉酶”(α-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，E.C.3.2.1.1)构成一组酶，这些酶催化淀粉以及其他直链和支链1,4-糖苷寡糖和多糖的水解。出于本专利技术的目的，根据实例部分中所述的程序确定α-淀粉酶活性。在一方面，本专利技术的变体具有SEQIDNO:1的成熟多肽的α-淀粉酶活性的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少100％。如本文使用的，术语‘氨基酸’包括标准二十种遗传编码的氨基酸及其相应的处于“d”型(与天然“l”型进行对比)的立体异构体、ω-氨基酸、其他天然存在的氨基酸、非常规氨基酸(例如α,α-双取代的氨基酸、N-烷基氨基酸等)和化学衍生的氨基酸。可以通过与功能性侧基团反应来实现一个或多个氨基酸的化学衍生物。此类衍生的分子包括例如，其中游离氨基基团已被衍生化以形成胺盐酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种亲本α‑淀粉酶的变体，其中所述变体包含(i)在对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的位置109、1、7、280、284、320、323和391的一个或多个位置处的修饰，以及任选地在对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的位置140、181、182、183、184、195、206、243、260、304和476的一个或多个位置中的修饰，(ii)所述变体与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7或8中所示的氨基酸序列具有至少80％，如至少90％、如至少95％、如至少97％，但小于100％的序列同一性，并且(iii)所述变体具有α‑淀粉酶活性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2017.03.27 EP 17163114.6;2017.02.01 IN 201741003681.一种亲本α-淀粉酶的变体，其中所述变体包含(i)在对应于SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列的位置109、1、7、280、284、320、323和391的一个或多个位置处的修饰，以及任选地在对应于SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列的位置140、181、182、183、184、195、206、243、260、304和476的一个或多个位置中的修饰，(ii)所述变体与SEQIDNO:1、2、3、4、5、6、7或8中所示的氨基酸序列具有至少80％，如至少90％、如至少95％、如至少97％，但小于100％的序列同一性，并且(iii)所述变体具有α-淀粉酶活性。2.根据权利要求1所述的变体，其中该修饰是缺失或取代。3.根据前述权利要求中任一项所述的变体，其中所述变体在对应于SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列的位置109、1、7、280、284、320、323和391的至少一个位置中包含修饰。4.根据前述权利要求中任一项所述的变体，其中所述变体在对应于SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列的位置109、1、7、140、181、182、183、184、195、206、243、260、280、284、304、320、323、391和476的至少一个位置中包含修饰。5.根据前述权利要求中任一项所述的变体，其中所述一个或多个修饰是取代。6.根据权利要求1至4中任一项所述的变体，其中所述一个或多个修饰中的至少一个是缺失。7.根据前述权利要求中任一项所述的变体，其中所述变体包含选自下组的至少两个位置中的修饰，该组由以下组成：1、109和391。8.根据前述权利要求中任一项所述的变体，其中所述一个或多个修饰选自下组，该组由以下组成：X1*、X1A、X7A、X7K、X7E、X7N、X7Q、X7L、X7D、X109A、X109S、X140Y、X181*、X182*、X183*、X184*、X195F、X206Y、X243F、X260G、X280S、X284H、X284R、X284F、X304R、X320A、X320M、X320T、X320V、X320S、X323N、X323R、X323S、X323K、X391A、X391V和X476K。9.根据前述权利要求中任一项所述的变体，其中所述变体具有改进的性能，如改进的洗涤性能。10.根据前述权利要求中任一项所述的变体，其中所述变体与该亲本α-淀粉酶的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，但小于100％的序列同一性。11.根据前述权利要求中任一项所述的变体，其中修饰的数目为1至30，例如1至20，例如1至10和1至5，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个修饰。12.根据前述权利要求中任一项所述的变体，其中所述变体在选自下组位置的位置中包含修饰，该组由以下组成：X1+X7；X1+X109；X1+X280；X1+X284；X1+X320；X1+X323；X1+X391；X109+X280；X109+X284；X109+X320；X109+X323；X109+X391；X7+X109；X7+X280；X7+X284；X7+X320；X7+X323；X7+X391；X280+X284；X280+X320；X280+X323；X280+X391；X284+X320；X284+X323；X284+X391；X320+X323；X320+X391；和X323+X391，其中根据SEQIDNO:1进行编号。13.根据前述权利要求中任一项所述的变体，其中所述变体在对应于SEQIDNO:2中所示的氨基酸序列的位置的位置中包含修饰，这些修饰选自下组，该组由以下组成：H1*+G109A+N280S+E391A；H1*+G7K+G109A+N280...

【专利技术属性】
技术研发人员：C安德森，I达马格，C加迪亚兰，RK塞纳坦，PV伊耶，
申请(专利权)人：诺维信公司，
类型：发明
国别省市：丹麦,DK