一种菊糖蔗糖酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种菊糖蔗糖酶突变体及其应用，属于酶工程领域。本发明专利技术首先对微生物Lactobacillus gasseri DSM 20604来源的菊糖蔗糖酶进行截断处理，在5’端和3’端分别截断411和702个核苷酸，得到氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的中间序列，然后在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的基础上，将第288位的天冬氨酸Asp突变为谷氨酸Glu后得到突变体酶D288E，突变体酶D288E的总酶活为326U/mg，与野生菊糖蔗糖酶(248U/mg)相比提高了31.45％，这一发现对于工业化制备菊糖具有重要的研究价值。

A mutant of Inulinase and its application

【技术实现步骤摘要】
一种菊糖蔗糖酶突变体及其应用
本专利技术涉及一种菊糖蔗糖酶突变体及其应用，属于酶工程领域。
技术介绍
果聚糖具有优异的理化性质和生理功能，在改善食品表观特性和营养价值上具有潜在的重大价值。如：可作为脂肪替代品，低热量的甜味剂、乳化剂、增稠剂和质构修饰剂应用于奶酪，酸奶，冰淇淋，面包以及许多其他的产品中以改善食品的质构、感官特性并提高食品货架期。此外，果聚糖在生理功能方面具有抗高血压、抗糖尿病、抗肥胖、抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗氧化、降血脂等显著特点。菊糖是果聚糖中的一种，由若干个果糖基分子和末端的一分子葡萄糖连接而成，且果糖基分子间通过β-(2,1)糖苷键连接。菊糖在植物中存在比较广泛，但是植物来源的菊糖总体分子量范围较低，且聚和度范围广。通过微生物来源的菊糖蔗糖酶利用蔗糖合成的菊糖普遍具有较大的分子量。因此，通过微生物酶法生产菊糖是必要且有效的途径。不同微生物来源的菊糖蔗糖酶，呈现出明显的产物特异性，主要表现为产物菊糖的分子量方面。目前，已经报道的菊糖蔗糖酶的来源菌株仅有15个，且仅有10个来源的菊糖蔗糖酶的氨基酸序列可通过NCBI查询到。且大多数菊糖蔗糖酶存在活力低下等问题，因此为进一步提高菊糖的产量，可以对菊糖蔗糖酶进行分子改造。
技术实现思路
为了解决上述存在的技术问题，本专利技术通过定点突变的办法，对来自微生物LactobacillusgasseriDSM20604的菊糖蔗糖酶进行分子改造，为进一步提高其催化活性以及得到更适合于工业应用的菊糖蔗糖酶(Laga-Iase)。本专利技术的第一个目的是提供一种菊糖蔗糖酶突变体，所述突变体的氨基酸序列包括：在SEQIDNO:1所示的氨基酸序列的基础上，将第288位的天冬氨酸突变为谷氨酸后得到的氨基酸序列。在一种实施方式中，所述突变体的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。本专利技术的第二个目的是提供编码所述突变体的基因。本专利技术的第三个目的是提供携带所述基因的载体或细胞。本专利技术的第四个目的是提供表达所述突变体的基因工程菌。在一种实施方式中，所述的基因工程菌以大肠杆菌为宿主。在一种实施方式中，所述的基因工程菌以pET-22b(+)为表达载体。本专利技术的第五个目的是提供一种制备菊糖的方法，所述方法是以所述突变体或含有所述突变体的全细胞为催化剂，以蔗糖为底物制备菊糖。在一种实施方式中，所述制备是以醋酸缓冲液作为缓冲体系。本专利技术还提供所述的突变体或所述的基因工程菌在医药生产、食品领域的应用。本专利技术的有益效果：本专利技术首先对微生物LactobacillusgasseriDSM20604来源的菊糖蔗糖酶进行截断处理，在5’端和3’端分别截断411和702个核苷酸，得到氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的中间序列，然后在SEQIDNO:1所示的氨基酸序列的基础上，将第288位的天冬氨酸突变为谷氨酸后得到突变体酶D288E，突变体酶D288E的总酶活为326U/mg，与野生菊糖蔗糖酶(248U/mg)相比提高了31.45％。附图说明图1：酶的纯化；M表示蛋白marker；1为纯化后的菊糖蔗糖酶；左侧数字为蛋白分子量，单位(kDa)。图2：相同条件下野生酶和突变体酶的比酶活比较。具体实施方式菊糖蔗糖酶比酶活的测定方法：1mL的反应体系，包括终浓度30％(w/v)的蔗糖、终浓度50mM的pH5.5的醋酸缓冲液和10μg/mL纯酶，在25℃条件下反应20min，沸水浴10min终止反应。菊糖蔗糖酶利用蔗糖合成菊糖涉及两步反应，第一步先将蔗糖裂解为葡萄糖和酶-果糖基中间物，第二步将果糖基转移到另一分子蔗糖上，化学反应式为：蔗糖+蔗糖-(2,1-β-D-果糖基)n→葡萄糖+蔗糖-(2,1-β-D-果糖基)n+1。因此，以蔗糖为唯一底物时菊糖蔗糖酶的活力包括总酶活、水解酶活和转糖基酶活三类，分别用反应体系中葡萄糖、果糖和两者之差表示。水解酶活代表蔗糖的水解，而转糖基酶活代表果聚糖的产生。1U菊糖蔗糖酶总酶活定义为：在pH5.5，25℃条件下反应，每分钟生成1μmol葡萄糖所需要的酶量。1U总水解酶活定义为在pH5.5，25℃条件下反应，每分钟生成1μmol果糖所需要的酶量。转糖基酶活为总酶活与水解酶活之差。比酶活为总酶活与反应体系中加酶量之比，单位U/mg。实施例1菊糖蔗糖酶突变体的制备(1)来源于微生物LactobacillusgasseriDSM20604的菊糖蔗糖酶(Laga-Isase)基因在GeneBank的编号为GU166814.1，基因全长2707个核苷酸。为了在表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)获得大量表达的目的蛋白，将全基因进行截断处理。在5’端和3’端分别截断411和702个核苷酸，仅保留中间序列，该中间序列的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。(2)pET-22b(+)-D288E突变质粒的构建以人工合成的pET-22b(+)-Laga-ISase为模板(其中Laga-ISase的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示)，经PCR-l，PCR-2及PCR-3三个步骤，引入D288E定点突变，测序验证结果表明除了所需突变位点外，没有出现随机突变，因此突变质粒pET-22b(+)-D288E构建成功。突变体酶的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示，核苷酸序列如SEQIDNO:4所示。PCR-1反应体系如下：以带有菊糖蔗糖酶目的基因的克隆质粒pET-22b(+)-Laga-ISase为模版。10×PCRBuffer5μLdNTP(2mmol/L)4μL上游外侧引物(10μM)1μL反向突变引物(10μM)1μLpET-22b(+)–Laga-ISase1μLTaqPlusDNApolymerase(5U/μL)0.5μLddH2O将体系补足50μLPCR-2反应体系如下：10×PCRBuffer5μLdNTP(2mmol/L)4μL下游外侧引物(10μM)1μL正向突变引物(10μM)1μLpET-22b(+)–Laga-ISase1μLTaqPlusDNApolymerase(5U/μL)0.5μLddH2O将体系补足50μLPCR-1、PCR-2的扩增条件为：94℃预变性4min；随后94℃变性1min，56℃退火lmin，72℃延伸1min，进行35个循环；最后72℃保温10min。PCR-1、PCR-2扩增产物经琼脂糖电泳检测，割胶回收纯化。PCR-3反应体系如下：PCR-3扩增条件为：94℃预变性4min；随后94℃变性1min，56℃退火lmin，72℃延伸1min，进行35个循环；最后72℃保温10min。经琼脂糖电泳胶回收纯化后的PCR-3扩增产物经限制性内切酶NdeI和XhoI酶切后连接至载体pET-22b(+)，得到重组质粒pET-22b(+)-D288E。表1引物序列表实施例2工程菌株的构建将实施例1中得到的重组质粒pET-22b(+)-Laga-Isase和pET-22b(+)-D288E分别转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，然后涂布于含有50μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基中培养过夜后，挑单克隆于50μg/mL氨节青霉素的LB液体培养基培养，后提取质粒pET-22b(+)-Laga-Isase和pET-22b(+)-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种菊糖蔗糖酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列包括：在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的基础上，将第288位的天冬氨酸突变为谷氨酸后得到的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种菊糖蔗糖酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列包括：在SEQIDNO:1所示的氨基酸序列的基础上，将第288位的天冬氨酸突变为谷氨酸后得到的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的菊糖蔗糖酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。3.编码权利要求1～2任一所述突变体的基因。4.携带权利要求3所述基因的载体或细胞。5.表达权利要求1～2任一所述突变体的基因工程菌。6.根据权利要求5所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：沐万孟，张文立，倪大伟，江波，张涛，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32