一种昆虫致敏蛋白的筛选方法技术

本发明专利技术公开了一种昆虫致敏蛋白的筛选方法，解决现有技术中没有高效、准确地筛选昆虫致敏蛋白的方法。本发明专利技术的筛选方法包括：步骤1：提取昆虫总蛋白后分离纯化，得到不同的蛋白组分样品；步骤2：采集对昆虫有、无过敏史的人体血清，采用蛋白微阵列实验从步骤1得到的不同蛋白组分样品中筛选出产生过敏反应的蛋白样品；步骤3：在步骤1得到的蛋白组分样品中选择包括产生过敏反应的蛋白样品的多个蛋白组分样品，用免疫印迹试验再次筛选出产生免疫反应的蛋白组分，并确定其分子量；步骤4.对步骤3筛选出的蛋白组分进行测序、检索，确定其氨基酸序列，检索出对应的基因序列，并分析序列的基本性质。本发明专利技术能高效、准确地筛选昆虫致敏蛋白。

A Screening Method for Insect Sensitizing Proteins

【技术实现步骤摘要】
一种昆虫致敏蛋白的筛选方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种昆虫致敏蛋白的筛选方法。
技术介绍
在蛋白质资源缺乏，亟需寻找可再生资源作为传统蛋白来源的补充品和替代品的背景下，蛋白资源昆虫的开发与利用应运而生。昆虫种类繁多、数量大、繁殖快、分布广泛，在某些地区和国家，长期以来一直被视为传统食物。另外，相关研究表明昆虫蛋白的营养成分高度多样化，比常见食用肉类更健康，且相对于动物蛋白源而言环境污染小。因此，昆虫蛋白质资源是目前未被充分利用的大型生物资源，将其转化为安全健康的蛋白质食物是解决蛋白质资源短缺问题的一种合理有效的途径。然而，该类蛋白食物与其他含蛋白质的食品一样具有引起少数食用者过敏的潜在风险，如何预测诊断与解决这一局限性问题成为缓解蛋白资源短缺的迫切需要。目前应用较多的检测某种昆虫蛋白的研究一般为通过与同类蛋白进行比对分析从而找寻、验证目标蛋白等，但由于关于昆虫致敏蛋白的研究甚少，且某些昆虫暂无近缘物种的相关研究作为参照进行比对研究。因此，将蛋白质组学和免疫学方法相结合是从昆虫全虫蛋白中定位筛选出致敏蛋白的最为行之有效的方法(Zhaoetal.,2015；Santosetal.,1999)。现阶段，蛋白组学中用于分离纯化昆虫总蛋白的方法主要是快速蛋白液相色谱法(Zhaoetal.,2016)；而免疫学中常用于过敏原测定的方法包括蛋白微阵列、酶联免疫吸附试验(ELISA)、肽质量指纹图谱(PMF)、放射性吸附试验(RAST)、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、免疫印迹(WB)、基质辅助激光解吸/电离-质谱(MALDI-MS)等(Barbaraetal.,2003；Linaresetal.,2008；Zhangetal.,2016)。利用此类方法，A.Lopata等人使用WB和immunoCAP检测分析确定原肌球蛋白为蝗虫的过敏蛋白(Lopataetal.,2015)；S.Kung等人将蛋白微阵列、WB、immunoCAP和RAST结合起来测定到谷胱甘肽转移酶或原肌球蛋白为蛾幼虫的过敏蛋白(Kungetal.,2011)。上述研究方法均为此类研究行之有效的手段，但关于虫源蛋白的获得方法不明确；免疫方法的选用较为多样，没有针对高效、准确地测定全虫蛋白这一目的来对各类方法进行择优组合优化；未明确排除测定过程中可能存在的交叉过敏反应的影响，得到的昆虫致敏蛋白的测定结果的特异性有待确。因此，提供一种昆虫致敏蛋白的筛选方法，方法简单，特异性高，成为了本领域技术人员亟待解决的问题。
技术实现思路
本专利技术解决的技术问题是：提供一种昆虫致敏蛋白的筛选方法，解决现有技术中，没有高效、准确地筛选昆虫致敏蛋白的方法。本专利技术采用的技术方案如下：本专利技术所述的一种昆虫致敏蛋白的筛选方法，包括以下步骤：步骤1.提取分离：提取昆虫总蛋白，而后进行分离纯化，得到不同的蛋白组分样品；步骤2.初步筛选：采集对所述昆虫有过敏史的血清、以及对所述昆虫无过敏史的血清，采用蛋白微阵列实验，对步骤1得到的不同蛋白组分样品进行筛选，初步筛选出产生过敏反应的蛋白样品；步骤3.二次筛选：在步骤1得到的蛋白组分样品中，选择包括所述产生过敏反应的蛋白样品在内的多个蛋白组分样品，采用免疫印迹试验，筛选出产生免疫反应的蛋白组分，并确定其分子量；步骤4.测序：对步骤3筛选出的蛋白组分进行测序、检索，确定其氨基酸序列，根据该氨基酸序列检索出对应的基因序列，并进行序列的基本性质分析。进一步地，所述步骤1中，先后采用快速液相色谱法和AKTAexplorer快速蛋白液相色谱系统分离纯化昆虫总蛋白。进一步地，所述步骤1中，将所述昆虫总蛋白采用快速液相色谱法分离后，根据分离纯化图，收集该图中各峰对应的样品，得到第一次分离纯化后的蛋白组分样品；而后将这些样品使用AKTAexplorer快速蛋白液相色谱系统再次进行分离纯化，根据AKTAexplorer快速蛋白液相色谱系统得到的分离纯化图，得到第二次纯化后的蛋白组分样品，并在测定蛋白组分样品的浓度后剔除浓度为负值的蛋白组分样品，保留有效蛋白组分样品。进一步地，还包括检测步骤：将步骤1分离纯化的蛋白组分样品经过浓度测定后筛除无效蛋白组分，再经SDS-PAGE检测，合格后才能用于后续步骤。进一步地，所述SDS-PAGE检测的具体操作为：选取所述昆虫总蛋白样品、第一次分离纯化后的蛋白组分样品、以及第二次分离纯化后的蛋白组分样品中浓度较高的蛋白组分样品进行第一次SDS-PAGE检测；而后根据第一次的检测结果，剔除第一次检测中浓度较低的蛋白样品(即电泳图谱颜色较浅，无明显条带的蛋白)，采用第二次分离纯化后的蛋白组分样品中其余浓度较高的样品进行替换，再次进行SDS-PAGE检测；根据两次SDS-PAGE检测的电泳图，确定各蛋白组分的分离纯化程度是否可以进行后续试验，并确定了两次分离纯化得到的蛋白组分样品中的高浓度样品。进一步地，所述步骤2的具体操作为：步骤A：根据所述步骤1得到所述昆虫总蛋白样品、第一次分离纯化后的蛋白组分样品、第二次纯化后的蛋白组分样品的个数、以及步骤2中人体血清样品个数，设置16孔硝化纤维素涂层载玻片数量，以使每个蛋白组分与每个血清反应，并且每个蛋白组分样品均设置空白对照孔和阳性对照孔；步骤B：封闭：根据步骤A中设计的结果，将所述步骤1得到的各个蛋白组分样品分别置于16孔硝化纤维素涂层载玻片中的各个样品孔后，用封闭液恒温封闭一段时间，而后洗涤，将载玻片离心甩干；步骤C：一抗孵育：分别采用对所述昆虫有过敏史的血清样本、对所述昆虫无过敏史的血清样本，稀释后作为一抗，加入到各个蛋白组分样品孔中，进行孵育操作，而后洗涤；空白对照孔中不加入一抗；步骤D：二抗孵育：将经步骤C处理后的载玻片每孔中加入二抗，孵育操作后洗涤、离心甩干；步骤E：将经步骤D处理后的载玻片用生物芯片扫描仪扫描读取数据。进一步地，所述步骤3的具体操作为：步骤a.将选定的蛋白组分样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后将凝胶中的蛋白条带转移至硝酸纤维素膜上；步骤b.将印有蛋白条带的硝酸纤维素膜从电泳仪中取出晾干，离心洗涤后，加入含有牛血清白蛋白的磷酸缓冲液，恒温旋转加热一段时间后，倒掉离心管中的溶液，洗涤，加入稀释人体血清后冷藏过夜；步骤c.次日，倒出人体血清，硝酸纤维素膜洗涤后加入二抗，恒温旋转加热；步骤d.而后洗涤，加入链霉抗生物素蛋白的稀释液，恒温静置一段时间后，倒出链霉抗生物素蛋白稀释液，洗涤；用Bio-RadECL化学发光底物染色后在凝胶成像系统中扫描分析。进一步地，所述步骤3中，每个蛋白组分样品均设置有实验组、阳性对照组和阴性对照组，其中，阳性对照组所用的人体血清为：步骤2中采集的对所述昆虫无过敏史的血清样本；阴性对照组为空白对照，不加入稀释人体血清，仅加入稀释液；实验组中加入的人体血清为步骤2中采集的对所述昆虫有过敏史的血清样本。进一步地，所述步骤4中，采用基质辅助激光解析/电离质谱法来确定筛选出的蛋白组分的种类及氨基酸序列。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术方法简单，操作简便，能高效、准确地筛选昆虫致敏蛋白。本专利技术涉及的昆虫蛋白材料来源于全虫，且经过两次昆虫蛋白的分离纯化，较已有的昆虫蛋白样品的分离纯化研本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种昆虫致敏蛋白的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1.提取分离：提取昆虫总蛋白，而后进行分离纯化，得到不同的蛋白组分样品；步骤2.初步筛选：采集对所述昆虫有过敏史的血清、以及对所述昆虫无过敏史的血清，采用蛋白微阵列实验，对步骤1得到的不同蛋白组分样品进行筛选，初步筛选出产生过敏反应的蛋白样品；步骤3.二次筛选：在步骤1得到的蛋白组分样品中，选择包括所述产生过敏反应的蛋白样品在内的多个蛋白组分样品，采用免疫印迹试验，筛选出产生免疫反应的蛋白组分，并确定其分子量；步骤4.测序：对步骤3筛选出的蛋白组分进行测序、检索，确定其氨基酸序列，根据该氨基酸序列检索出对应的基因序列，并进行序列的基本性质分析。

【技术特征摘要】
1.一种昆虫致敏蛋白的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1.提取分离：提取昆虫总蛋白，而后进行分离纯化，得到不同的蛋白组分样品；步骤2.初步筛选：采集对所述昆虫有过敏史的血清、以及对所述昆虫无过敏史的血清，采用蛋白微阵列实验，对步骤1得到的不同蛋白组分样品进行筛选，初步筛选出产生过敏反应的蛋白样品；步骤3.二次筛选：在步骤1得到的蛋白组分样品中，选择包括所述产生过敏反应的蛋白样品在内的多个蛋白组分样品，采用免疫印迹试验，筛选出产生免疫反应的蛋白组分，并确定其分子量；步骤4.测序：对步骤3筛选出的蛋白组分进行测序、检索，确定其氨基酸序列，根据该氨基酸序列检索出对应的基因序列，并进行序列的基本性质分析。2.根据权利要求1所述的一种昆虫致敏蛋白的筛选方法，其特征在于，所述步骤1中，先后采用快速液相色谱法和AKTAexplorer快速蛋白液相色谱系统分离纯化昆虫总蛋白。3.根据权利要求2所述的一种昆虫致敏蛋白的筛选方法，其特征在于，所述步骤1中，将所述昆虫总蛋白采用快速液相色谱法分离后，根据分离纯化图，收集该图中各峰对应的样品，得到第一次分离纯化后的蛋白组分样品；而后将这些样品使用AKTAexplorer快速蛋白液相色谱系统再次进行分离纯化，根据AKTAexplorer快速蛋白液相色谱系统得到的分离纯化图，得到第二次纯化后的蛋白组分样品，并在测定蛋白组分样品的浓度后剔除浓度为负值的蛋白组分样品，保留有效蛋白组分样品。4.根据权利要求1-3任意一项所述的一种昆虫致敏蛋白的筛选方法，其特征在于，还包括检测步骤：将步骤1分离纯化的蛋白组分样品经过浓度测定后筛除无效蛋白组分，再经SDS-PAGE检测，合格后才能用于后续步骤。5.根据权利要求4所述的一种昆虫致敏蛋白的筛选方法，其特征在于，所述SDS-PAGE检测的具体操作为：选取所述昆虫总蛋白样品、第一次分离纯化后的蛋白组分样品、以及第二次分离纯化后的蛋白组分样品中浓度较高的蛋白组分样品进行第一次SDS-PAGE检测；而后根据第一次的检测结果，剔除第一次检测中浓度较低的蛋白样品，采用第二次分离纯化后的蛋白组分样品中其余浓度较高的样品进行替换，再次进行SDS-PAGE检测；根据两次SDS-PAGE检测的电泳图，确定各蛋白组分的分离纯化程度是否可以进行后续试验，并确定了两次分离纯化得到的蛋白组...

【专利技术属性】
技术研发人员：王南溪，杨伟，杨桦，杨春平，方睿，钱丽芝，朱晓庆，管凤荣，王保新，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川,51