本发明专利技术涉及尿液中妊娠糖尿病的蛋白质标志物及其在早期诊断中的用途。具体而言，本发明专利技术涉及选自以下的蛋白质的鉴定试剂在制备用于妊娠糖尿病早期诊断的试剂中的用途：NOV蛋白同源物(Protein NOV homolog)、过氧化物还原酶‑5(Peroxiredoxin‑5，PRDX‑5)、肝细胞生长因子样蛋白(Hepatocyte growth factor‑like protein，HFGL)及其组合。这三种蛋白质NOV蛋白同源物，过氧化物还原酶‑5和肝细胞生长因子样蛋白及其组合对于妊娠糖尿病的早期诊断等方面具有较好的临床应用前景。
Protein markers of gestational diabetes mellitus in urine and their application in early diagnosis
【技术实现步骤摘要】
尿液中妊娠糖尿病的蛋白质标志物及其在早期诊断中的用途专利
本专利技术涉及生物
，更具体地涉及受试者样品，例如尿液中妊娠糖尿病的蛋白质标志物及其在早期诊断中的用途。专利技术背景妊娠期糖尿病(Gestationaldiabetesmellitus，GDM)是指在孕期发生或首次发现的糖耐量异常。根据不同人群和诊断标准，GDM的发病率最高已达18％，而与其他种族相比，亚裔女性在妊娠期更容易发生GDM。GDM对胎儿及孕妇的健康均有不良影响，可能引起胎停育、早产、难产、感染、巨大儿、新生儿黄疸、新生儿低血糖症、高胆红素血症、先兆子痫等。GDM患者及其胎儿将来患糖尿病、肥胖和代谢综合征的风险显著增加，不仅增加了患病家庭的生活负担，而且极大地增加国家医保支出。因此，早期识别GDM易患人群十分重要，以便尽早严格控制危险因素，预防高血糖状态的出现，降低不良妊娠结局及将来罹患代谢性疾病的风险。同时，GDM也是2型糖尿病的预警状态，其早期预测指标必然有益于对2型糖尿病的预测。目前比较公认的GDM诊断方法是在孕24周至28周进行75g口服葡萄糖耐量试验，明确诊断时间相对滞后，如果存在孕前或孕早期准确预测即将发生GDM人群的标志物，临床早期干预就更有针对性。许多研究者曾使用包括酶联免疫吸附分析在内的经典方法进行研究，筛选出脂联素、游离脂肪酸、性激素结合球蛋白及胎盘生长激素等指标作为备选的GDM早期诊断标志物。但由于这些指标特异性差，且只从已知成熟的指标中进行筛选，范围小，其敏感性和特异性均有待考量，未得到公认。因此，采用先进的蛋白质研究技术直接在蛋白水平探索新的、更佳的、临床更为实用的GDM早期诊断标志物是十分必要的。目前，国内外许多实验室利用蛋白质组学技术，在血浆中检测妊娠糖尿病的差异表达。2009年索明莉等人首次使用蛋白质组学方法应用于GDM的研究。该研究应用SELDI-TOF-MS技术检测并绘制了30例GDM患者和30例正常孕妇的血清蛋白质谱图，发现了质荷比为2868.9、3448.3、5477.7、4695.5和4786.7的蛋白质质在两组间差异表达。近年来越来越多实验室利用SELDI-TOF技术，LC-MS定量技术，iTRAQ定量技术、TMT定量技术在血浆蛋白质组中鉴定妊娠糖尿病标志物。C反应蛋白,性激素结合球蛋白,Ficolin3、妊娠特异beta-1糖蛋白4，脂蛋白E、凝血因子9，纤维蛋白原α链，胰岛素类生长激素结合蛋白5等一系列潜在妊娠糖尿病标志物被发现和验证。因此，本领域急需检测妊娠糖尿病的快速、灵敏且有效的方法。专利技术概述与血液样本不同，尿液中含有较少的白蛋白和免疫球蛋白等高丰度蛋白，能够减少疾病标记物发现过程中高丰度蛋白抑制的现象。另外，尿液样本不仅包含血浆中的成分，还含有许多不同反应通路的系统代谢物，含有相对较全的生物信息。基于以上优势，采用尿蛋白质组学策略打开了发现妊娠糖尿病相关蛋白质的一个新的窗口。靶向分析(平行反应)监测(ParallelReactionMonitoring,PRM)是一种基于二级质谱信号的靶标质谱定量分析技术，相较于传统的选择反应监测(SelectedReactionMonitoring，SRM)技术，无需预先设计靶向蛋白质的母离子/子离子配对信息，节约实验设计和操作时间；且选择性更高，灵敏度更佳，重现性更好，在复杂背景中的抗干扰能力更强。它无需商品化抗体，克服了基于免疫方法对抗体特异性和滴度的限制。靶向分析(平行反应)监测技术能够同时对多种蛋白质进行定性和定量分析。在本申请中，我们收集15例妊娠糖尿病早期的尿液和15例正常妊娠的尿液(妊娠6-10周)，采用新型DIA非标记定量技术对尿液蛋白质组进行定量分析。通过对OPLSDA监督聚类分析，差异倍数分析和T检验分析，选择48个潜在的生物标记物，开发了基于靶向质谱检测技术同时对NOV蛋白同源物(ProteinNOVhomolog)、肝细胞生长因子样蛋白(Hepatocytegrowthfactor-likeprotein)等蛋白质进行检测的方法，对收集15例妊娠糖尿病早期的尿液和15例正常妊娠的尿液(妊娠6-10周)进行分析，并利用质谱数据分析结果。我们发现NOV蛋白同源物(ProteinNOVhomolog)、过氧化物还原酶-5(Peroxiredoxin-5，PRDX-5)、肝细胞生长因子样蛋白(Hepatocytegrowthfactor-likeprotein，HFGL)的靶向质谱数据对上述15例妊娠糖尿病组和15例正常妊娠对照组有很好的区分度，能快速、准确有效地诊断妊娠糖尿病，而其组合使用时的表现尤其突出。检测这三种生物标记物可以应用于妊娠糖尿病的早期诊断监测，具有良好的临床应用前景。附图简述图1A至图1C：三种蛋白特征肽段的MRM离子对图谱。其中：图1A为：NOV蛋白同源物标签肽段AVLDGCSCCLVCAR的离子对图谱；图1B为：过氧化物还原酶-5(PRDX-5)标签肽段LLADPTGAFGK的离子对图谱；图1C为：肝细胞生长因子样蛋白(HFGL)的标签肽SPLNDFQVLR的离子对图谱；图2A至图2B：MRM分析的精确性，其中：图2A和图2B分别为NOV蛋白同源物(R2＝0.8128)的同一个蛋白两个肽在不同样品中定量结果一致性图。图3A至图3C：NOV蛋白同源物(图3A)、过氧化物还原酶-5(PRDX-5，图3B)、细胞生长因子样蛋白(HFGL，图3C)在正常妊娠组和妊娠糖尿病组(治疗前和治疗后)的MRM检测结果。CON为正常妊娠组，GDM为妊娠糖尿病足。图4：在图4A至图4D中，图4A代表NOV蛋白同源物和过氧化物还原酶-5组合的ROC曲线，图4B代表NOV蛋白同源物和肝细胞生长因子样蛋白的组合ROC曲线，图4C代表过氧化物还原酶-5和肝细胞生长因子样蛋白的组合的ROC曲线(图4C)和图4D代表三种蛋白质组合的ROC曲线。专利技术详述鉴于本领域的急需检测妊娠糖尿病的快速、灵敏且有效的方法的需求，在一方面，本申请提供了质谱鉴定试剂，其选自以下的任一种或多种：1)SEQIDNO:1所示的NOV蛋白同源物的标签肽的鉴定试剂；2)SEQIDNO:2所示的NOV的标签肽的鉴定试剂；3)SEQIDNO:3所示的过氧化物还原酶-5(PRDX-5)的标签肽的鉴定试剂；4)SEQIDNO:4所示的肝细胞生长因子样蛋白(HFGL)的标签肽的鉴定试剂。另一方面，本申请提供了鉴定试剂在制备组合物中的用途，所述组合物用于诊断受试者的妊娠糖尿病的方法，所述鉴定试剂选自以下的任一种或多种：1)用于NOV蛋白同源物的鉴定试剂；2)用于过氧化物还原酶-5的鉴定试剂；3)用于肝细胞生长因子样蛋白的鉴定试剂，其中所述方法包括以下步骤：a.从所述受试者获得样品，b.任选地，从样品中分离其中所包含的蛋白质，c.使用鉴定试剂，试剂盒或芯片确定来自所述受试者的样品中选自以下的任一种或多种蛋白质的表达水平：NOV蛋白同源物、过氧化物还原酶-5、肝细胞生长因子样蛋白，优选地，将上述表达水平与健康对照进行比较。在具体的实施方案中，所述诊断是指妊娠糖尿病的早期诊断。所述早期诊断是指：妊娠6-10周的妊娠糖尿病诊断。在一个实施方案中，在上述鉴定试剂用于制备组合本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.质谱鉴定试剂，其选自以下的任一种或多种：1)SEQ ID NO:1所示的蛋白NOV蛋白同源物(Protein NOV homolog)的标签肽的鉴定试剂；2)SEQ ID NO:2所示的NOV的标签肽的鉴定试剂；3)SEQ ID NO:3所示的过氧化物还原酶‑5(Peroxiredoxin‑5，PRDX‑5)的标签肽的鉴定试剂；4)SEQ ID NO:4所示的肝细胞生长因子样蛋白(Hepatocyte growth factor‑like protein，HFGL)的标签肽的鉴定试剂。
【技术特征摘要】
1.质谱鉴定试剂，其选自以下的任一种或多种：1)SEQIDNO:1所示的蛋白NOV蛋白同源物(ProteinNOVhomolog)的标签肽的鉴定试剂；2)SEQIDNO:2所示的NOV的标签肽的鉴定试剂；3)SEQIDNO:3所示的过氧化物还原酶-5(Peroxiredoxin-5，PRDX-5)的标签肽的鉴定试剂；4)SEQIDNO:4所示的肝细胞生长因子样蛋白(Hepatocytegrowthfactor-likeprotein，HFGL)的标签肽的鉴定试剂。2.鉴定试剂在制备组合物中的用途，所述组合物用于诊断受试者的妊娠糖尿病，优选早期妊娠糖尿病，即妊娠6-10周的妊娠糖尿病的方法，所述鉴定试剂选自以下的任一种或多种：1)用于NOV蛋白同源物的鉴定试剂；2)用于过氧化物还原酶-5的鉴定试剂；3)用于肝细胞生长因子样蛋白的鉴定试剂；优选，其中所述鉴定试剂是质谱鉴定试剂，优选为权利要求1的质谱鉴定试剂、抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体优选是单克隆抗体，所述抗原结合片段优选包括但不限于：Fab、Fab'、(Fab')2、Fv、ScFv、双特异抗体、三特异抗体、四特异抗体、双-scFv。3.根据权利要求2所述的用途，其中选自以下的任一项或多项指示所述受试者患有妊娠糖尿病：1)相比于健康对照，NOV蛋白同源物表达升高；2)相比于健康对照，肝细胞生长因子样蛋白表达升高；3)相比于健康对照，过氧化物还原酶-5的表达降低。4.根据权利要求2或3所述的用途，其中包括使用质谱方法、ELISA方法、或Western方法确定所述蛋白质的表达水平。5.根据权利要求4所述的用途，其中当使用质谱方法确定蛋白质的表达水平时，包括从受试者样品，优选尿液中分离蛋白质，优选还包括消化样品中的蛋白质，优选地用胰蛋白酶消化样品中的蛋白质的步骤。6.根据权利要求2所述的用途，其中所述质谱鉴定试剂是在靶向分析中使用的。7.一种用于受试者妊娠糖尿病诊断，优选早期妊娠糖尿病，即妊娠6-10周的妊娠糖尿病的...
【专利技术属性】
技术研发人员：不公告发明人，
申请(专利权)人：安肽和杭州医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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