毒黄素半抗原、人工抗原、抗体及其合成方法和应用技术

本发明专利技术公开了毒黄素半抗原及毒黄素人工抗原的制备方法，用所制备的人工抗原免疫动物可以获得高特异、高灵敏的抗体。用本发明专利技术所公开的技术方案制备的抗原、抗体，以及样品处理方案，可为毒黄素的高灵敏检测提供简便快捷的技术途径。

Toxaflavin hapten, artificial antigen, antibody and their synthetic methods and Applications

【技术实现步骤摘要】
毒黄素半抗原、人工抗原、抗体及其合成方法和应用
本专利技术涉及了免疫化学分析
，特别是涉及了毒黄素半抗原、人工抗原、抗体及其合成方法和应用。
技术介绍
酵米面中毒是我国广大农村致死率极高的一种细菌性食物中毒。椰毒假单胞菌酵米面亚种是引起酵米面食物中毒和变质银耳中毒的原因，研究证明该菌的致病物质是其在生长繁殖过程中产生的两种毒素：米酵菌酸(bongkrekicacid，BA)和毒黄素(toxoflavin，TF)。两种毒素均为脂肪酸类的小分子物质，具有剧毒、耐热、毒性强，不能被一般的烹调方法所破坏，故食品被污染后极易引起中毒，目前尚无特效解毒药物，且米酵菌酸的产量远高于毒黄素。目前用于检测米酵菌酸的方法主要有传统的检测方法，如分光光度法、高效液相色谱法及其联用技术等，以上方法虽然可以精确定量，但由于设备仪器昂贵，检测时间长，且需专业人员操作，因此无法实现真正意义上的现场检测。而免疫学检测分析技术以其高灵敏、特异性高、快速、操作简便等优点在药物残留检测领域已被广泛应用，比起仪器等检验方法有很多优势。所以免疫分析为米酵菌酸残留研究提供了一条新的分析检测方法。在建立免疫学检测方法并应用该检测方法检测米酵菌酸残留量时，关键技术在于能够获取到特异性强、灵敏度高的抗体，而要实现这一目标，前提条件就是得合成、制备出合适的米酵菌酸半抗原。但是米酵菌酸为链状结构，免疫动物难以获得高质量的抗体。而毒黄素则是由两个并环组成的立体状的分子，相对于米酵菌酸，免疫动物更容易获得高灵敏、高特异的抗体。通过免疫检测毒黄素可以间接检测米酵菌酸，对米酵菌酸的中毒检测提供一种简便可靠的检测方案。但是，目前，国内还没有针对毒黄素半抗原的相关报道。
技术实现思路
为了弥补已有技术的缺陷，本专利技术提供毒黄素半抗原、人工抗原、抗体及其合成方法和应用。本专利技术所要解决的技术问题通过以下技术方案予以实现：毒黄素半抗原，其具有如下结构式：其中，n为-CH2基团数目，n为1-7的整数。本专利技术还提供上述毒黄素半抗原的合成方法，包括如下步骤：S1.甲基肼与化合物1进行反应，得到化合物2，所述化合物1具有结构式所述化合物2具有结构式S2.在酸性条件下，所述化合物2与甲醛进行反应，得到化合物3，所述化合物3具有结构式S3.在亚硝酸钠和乙酸存在下，所述化合物3进行反应，得到化合物4，所述化合物4具有结构式S4.所述化合物4进行水解反应，得到所述毒黄素半抗原。进一步地，所述化合物1的合成方法为：(1)提供化合物A，所述化合物A的分子式为NH2(CH2)nCOOEt；(2)所述化合物A与三甲基硅基异氰酸酯进行反应，得到化合物B，所述化合物B具有结构式所述化合物B与丙二酸、乙酸酐进行反应，得到化合物C，所述化合物C具有结构式所述化合物C与三氯氧磷进行反应，得到所述化合物1。本专利技术还提供毒黄素人工抗原，所述毒黄素人工抗原包括毒黄素免疫抗原和毒黄素包被抗原，其是由上述毒黄素半抗原与载体蛋白偶联得到的。进一步地，所述载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)，卵清蛋白(OVA)，人血清白蛋白(HAS)或血蓝蛋白(KLH)中的任意一种。进一步地，制备毒黄素免疫抗原时，所述毒黄素半抗原结构中，2≤n≤7；制备毒黄素包被抗原时，所述毒黄素半抗原结构中，1≤n≤6。进一步地，制备毒黄素免疫抗原时，所述毒黄素半抗原结构中，n为4；制备毒黄素包被抗原时，所述毒黄素半抗原结构中，n为4。本专利技术还提供毒黄素人工抗原的合成方法，其是采用混合酸酐法将所述毒黄素半抗原与载体蛋白偶联制备得到。本专利技术还提供一种毒黄素抗体，它是由上述毒黄素免疫抗原经动物免疫得到。一种检测毒黄素的免疫学方法，其采用上述毒黄素抗体。进一步地，待测样品经甲醇和盐酸羟胺处理，其中，所述盐酸羟胺的浓度为0.2M-0.8M。进一步地，所述免疫学方法为免疫层析法、酶联免疫吸附试验、时间分辨荧光免疫分析、化学发光免疫分析在内的任意一种免疫学分析方法。特别说明，本申请文件中化学结构式中Et为乙基；Ac为乙酰基；Me为甲基。本专利技术具有如下有益效果：本专利技术中，在毒黄素6位上的氮原子上衍生脂肪链连接臂，衍生的脂肪链连接臂末段带有羧基，本专利技术的毒黄素半抗原最大程度保留了毒黄素的特征结构，能更好地暴露半抗原的抗原决定簇，使得毒黄素半抗原的免疫原性明显增强，又具有可以与载体蛋白发生偶联的羧基；该毒黄素半抗原与载体蛋白偶联后得到的毒黄素免疫抗原去免疫动物，更有利于刺激动物免疫应答产生特异性更强、灵敏度更高的抗体，采用该抗体的免疫学方法可以检测出0.03ng/ml的毒黄素污染，为米酵菌酸中毒提供了简便快捷的解决方案，整个检测流程只需要十多分钟，完全能够满足实际检测需求。本专利技术中毒黄素半抗原的合成方法，使用的原料易得，反应操作较为简单，反应条件易于控制。本专利技术的毒黄素半抗原合成方法，合成路线简单，毒黄素半抗原的纯度和收率高，整体的合成成本更具优势。附图说明图1为本专利技术毒黄素半抗原的合成路线。具体实施方式第一方面，本专利技术提供毒黄素半抗原，其具有如下结构式：其中，n为-CH2基团数目，n为1-7的整数。人工抗原的合成是免疫检测中抗体制备和建立免疫分析方法最关键的步骤，半抗原的合成是人工抗原合成的关键。毒黄素因分子量小而不具有免疫原性(分子量小于1000)，不能在动物体内产生抗体，必须与大分子载体蛋白偶联制备人工抗原，才能诱导特异性抗体的产生。由于毒黄素分子上没有可以直接与载体蛋白偶联的活性基团，因此需先通过衍生过程在毒黄素小分子上适当的位置引入合适的连接臂和与载体蛋白偶联的活性基团。不同结构的连接臂、不同的偶联方法或连接臂的引入位置，都影响后续建立的免疫学方法检测的灵敏度和特异性。目前，以毒黄素衍生物为半抗原制备合成抗体和人工抗原进行检测毒黄素的免疫学方法鲜有报道。本专利技术中，在毒黄素6位上的氮原子上衍生脂肪链连接臂，衍生的脂肪链连接臂末段带有羧基，本专利技术的毒黄素半抗原最大程度保留了毒黄素的特征结构，能更好地暴露半抗原的抗原决定簇，使得毒黄素半抗原的免疫原性明显增强，又具有可以与载体蛋白发生偶联的羧基；该毒黄素半抗原与载体蛋白偶联后得到的毒黄素免疫抗原去免疫动物，更有利于刺激动物免疫应答产生特异性更强、灵敏度更高的抗体，采用该抗体的免疫学方法可以检测出0.03ng/ml的毒黄素污染，为米酵菌酸中毒提供了简便快捷的解决方案，整个检测流程只需要十多分钟，完全能够满足实际检测需求。本专利技术的毒黄素半抗原，不仅合成方法简便、纯度较高，而且能应用于合成适于动物免疫的抗原体系，弥补了国内毒黄素免疫学方法
的空白，为毒黄素免疫检测方法的进一步发展奠定了基础。第二方面，本专利技术提供上述毒黄素半抗原的合成方法。具体地，上述结构的毒黄素半抗原的合成方法包括如下步骤：S1.甲基肼与化合物1进行反应，得到化合物2，所述化合物1具有结构式所述化合物2具有结构式此步骤中，甲基肼与化合物1进行取代反应，其原理都为本技术人员均可通过技术手册得知或通过常规实验方法获知，本专利技术对反应的具体操作不作具体限定，本领域技术人员可以根据实际需要进行常规调整。S2.在酸性条件下，所述化合物2与甲醛进行反应，得到化合物3，所述化合物3具有结构式此步骤中，化合物2和甲醛在酸性条件下进行羰胺缩合反应，形成碳氮双键本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.毒黄素半抗原，其特征在于，其具有如下结构式：

【技术特征摘要】
1.毒黄素半抗原，其特征在于，其具有如下结构式：其中，n为-CH2基团数目，n为1-7的整数。2.如权利要求1所述的述毒黄素半抗原的合成方法，其特征在于，其包括如下步骤：S1.甲基肼与化合物1进行反应，得到化合物2，所述化合物1具有结构式所述化合物2具有结构式S2.在酸性条件下，所述化合物2与甲醛进行反应，得到化合物3，所述化合物3具有结构式S3.在亚硝酸钠和乙酸存在下，所述化合物3进行反应，得到化合物4，所述化合物4具有结构式S4.所述化合物4进行水解反应，得到所述毒黄素半抗原。3.如权利要求1所述的述毒黄素半抗原的合成方法，其特征在于，所述化合物1的合成方法为：(1)提供化合物A，所述化合物A的分子式为NH2(CH2)nCOOEt；(2)所述化合物A与三甲基硅基异氰酸酯进行反应，得到化合物B，所述化合物B具有结构式(3)所述化合物B与丙二酸、乙酸酐进行反应，得到化合物C，所述化合物C具有结构式(4)所述化合物C与三氯氧磷进行反应，得到所述化合物1...

【专利技术属性】
技术研发人员：柯跃斌，李金峰，黎诚耀，丁晔，赵芳，肖云军，刘博超，
申请(专利权)人：深圳市疾病预防控制中心深圳市卫生检验中心，深圳市预防医学研究所，
类型：发明
国别省市：广东,44