一种MTHFR基因C677T位点快速分型检测试剂盒及方法技术

本发明专利技术提供了一种MTHFR基因C677T位点快速分型检测试剂盒及方法。具体地，本发明专利技术采用经简单处理的血液样本，然后采用经典的荧光PCR直接对MTHFR C677T位点多态性进行检测。此检测方法无需对样本进行核酸提取或纯化，仅需少量样本便可对MTHFR C677T位点准确分型，克服了传统PCR反应对核酸提取的依赖、简化了检测流程、极大缩短了SNP分型时间、降低了研究成本和技术复杂性。

A Kit and Method for Rapid Typing of C677T Locus of MTHFR Gene

【技术实现步骤摘要】
一种MTHFR基因C677T位点快速分型检测试剂盒及方法
本专利技术属于生物技术和检测领域，具体地说，本专利技术涉及一种MTHFR基因C677T位点快速分型检测试剂盒及方法。
技术介绍
亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)是叶酸转运和代谢的关键酶。MTHFR催化5，10-亚甲基四氢叶酸还原为5-甲基四氢叶酸，一类参与核苷酸合成与修复；一类与MTRR一起参与甲基传递通路，维持血液同型半胱氨酸的正常水平，为DNA和蛋白质的合成提供甲基。MTHFR基因突变可导致其酶活性降低，引起叶酸代谢障碍，血液中同型半胱氨酸水平上升，导致孕妇妊娠期高血压，自发性流产，新生儿神经管缺陷、先天性心脏病、唇腭裂、唐氏综合征等疾病的发病风险提高。目前，MTHFR基因677C>T位点常用的检测方法有基于PCR方法的等位基因特异性PCR法(AS-PCR)、荧光PCR法和测序法，这些检测方法均需要以核酸为模板进行检测，常用的核酸提取方法有磁珠核酸提取法和柱提核酸提取法。常见的单核苷酸多态性检测方法包括：(1)等位基因特异性聚合酶链反应(allelespecificPGR，AS-PCR)是一种较为简单的检测SNP基因型的策略。其基本原理是根据SNP位点的碱基类型设计引物，这种引物包括一条共用的上游引物(或下游引物)链，一条特异性下游引物(或上游引物)链。共用引物链按常规方法进行设计，特异性引物链需根据SNP位点的突变方向及类型对特异链的3'端最后一个碱基进行设置。野生型和突变型特异性引物链是分别与共用引物链在两支不同的PCR管中进行反应的，随后通过琼脂糖凝胶电泳检测是否有目的PCR产物的产生，从而达到SNP基因分型的目的。(2)荧光PCR法是PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；刚开始时，探针结合在DNA任意一条单链上；PCR扩增时，Taq酶的5’端～3’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。采用“等位基因特异PCR”技术结合荧光探针检测特异性扩增产物。只有当等位基因特异性引物3’末端碱基与对应的等位基因型模板完全互补配对时，PCR扩增反应可以正常进行而得到特定产物，并产生荧光信号，反之，则无特异性PCR扩增反应，因而观察不到荧光信号或其Ct值非常高。(3)CE测序法适合对短基因片断的SNP筛查，通过直接测序方法进行SNP检测的检出率准确度接近100％；其原理为：将可能的SNP位点进行PCR扩增，结合DNA测序找到SNP位点并确定碱基替换类型。但是缺点是周期长，费用大，且容易发生交叉污染。常见的核酸提取方法包括：(1)磁珠核酸提取法是依据磁珠结合液中含强有力的蛋白质变性剂，能迅速溶解蛋白质，使核酸解离出来；在其存在的情况下，释放出来的核酸成分可以结合在磁珠上，随后通过磁珠洗涤液的作用，将蛋白质、无机盐离子和许多有机杂志去除。然后洗脱液将纯净的核酸洗脱下来。(2)柱提核酸提取法是采用高效裂解缓冲系统，结合硅胶膜吸附柱技术快速高效的提取样本中的核酸。裂解液中含强有力的蛋白质变性剂，能迅速溶解蛋白质，使蛋白质解离出来；在裂解液和乙醇存在下，释放出来的核酸成分可以结合在硅胶膜上；随后通过抑制物去除液、去离子液作用，将蛋白质、无机盐离子和许多有机杂质除去。然后洗脱液将纯净的核酸洗脱下来。目前单核苷酸多态(singlenucleotidepolymorphismSNP)的检测多采用外周血样本提取的基因组DNA，由于该方法不适于现场操作，且受到样本保存条件和DNA提取效果的限制，在大规模人群SNP筛检中不易推广。因此，本领域迫切需要开发高特异性、高灵敏度、操作简单的检测MTHFR基因C677T位点基因多态性的技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种MTHFR基因C677T位点快速分型检测试剂盒及方法。在本专利技术的第一方面，提供了一种检测MTHFR基因多态性的引物组，所述引物组包括：MTHFR基因C677T位点的上游引物：5’-GAGGCCAGCCTCTCCTGAC-3’；MTHFR基因C677T位点野生型下游引物：5’-CTGCGTGATGATGAAATATG-3’；和MTHFR基因C677T位点突变型下游引物：5’-CTGCGTGATGATGAAATATA-3’。在另一优选例中，所述引物组还包括：内控上游引物：5’-GTGGCATAGTGGGGTGGTGA-3’；和内控下游引物：5’-GCTCCTCCCACACCAGCTTTG-3’。本专利技术的第二方面，提供了一种检测MTHFR基因多态性的探针组，所述探针组包括：MTHFR基因C677T位点探针：5’-GCCACCCCGAAGCAGGGAGCT-3’。在另一优选例中，所述探针组还包括：内控探针：5’-ATTCGCCCTCTTAATGGGGAGG-3’。在另一优选例中，所述MTHFR基因C677T位点探针的5’端包含有荧光报告基团；和/或，所述探针的3’端包含有荧光淬灭基团。在另一优选例中，所述内控探针的5’端包含有不同于所述MTHFR基因C677T位点探针的荧光报告基团；和/或，所述探针的3’端包含有荧光淬灭基团。本专利技术的第三方面，提供了一种用于检测MTHFR基因多态性的试剂盒，所述试剂盒包括本专利技术第一方面所述的引物组。在另一优选例中，所述试剂盒还包括本专利技术第二方面所述的探针组。在另一优选例中，所述试剂盒包括独立分装的第一引物探针混合液和第二引物探针混合液，其中，所述第一引物探针混合液包括：MTHFR基因C677T位点的上游引物：5’-GAGGCCAGCCTCTCCTGAC-3’；MTHFR基因C677T位点突变型下游引物：5’-CTGCGTGATGATGAAATATA-3’；和MTHFR基因C677T位点探针：5’-GCCACCCCGAAGCAGGGAGCT-3’。所述第二引物探针混合液包括：MTHFR基因C677T位点的上游引物：5’-GAGGCCAGCCTCTCCTGAC-3’；MTHFR基因C677T位点野生型下游引物：5’-CTGCGTGATGATGAAATATG-3’；和MTHFR基因C677T位点探针：5’-GCCACCCCGAAGCAGGGAGCT-3’。在另一优选例中，所述第一引物探针混合液和/或所述第二引物探针混合液还包括：内控上游引物：5’-GTGGCATAGTGGGGTGGTGA-3’；内控下游引物：5’-GCTCCTCCCACACCAGCTTTG-3’；和内控探针：5’-ATTCGCCCTCTTAATGGGGAGG-3’。在另一优选例中，所述试剂盒还包括独立分装的阳性对照，和/或阴性对照。在另一优选例中，所述试剂盒还包括荧光PCR反应酶；和/或荧光PCR用缓冲液。本专利技术的第四方面，提供了一种检测MTHFR基因多态性的方法，所述方法包括步骤：(1)提供待检测对象的DNA样本；(2)制备PCR反应体系并进行PCR检测：其中，所述PCR反应体系包括步骤(1)提供的所述DNA样本、本专利技术第一方本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测MTHFR基因多态性的引物组，其特征在于，所述引物组包括：MTHFR基因C677T位点的上游引物：5’‑GAGGCCAGCCTCTCCTGAC‑3’；MTHFR基因C677T位点野生型下游引物：5’‑CTGCGTGATGATGAAATATG‑3’；和MTHFR基因C677T位点突变型下游引物：5’‑CTGCGTGATGATGAAATATA‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种检测MTHFR基因多态性的引物组，其特征在于，所述引物组包括：MTHFR基因C677T位点的上游引物：5’-GAGGCCAGCCTCTCCTGAC-3’；MTHFR基因C677T位点野生型下游引物：5’-CTGCGTGATGATGAAATATG-3’；和MTHFR基因C677T位点突变型下游引物：5’-CTGCGTGATGATGAAATATA-3’。2.如权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述引物组还包括：内控上游引物：5’-GTGGCATAGTGGGGTGGTGA-3’；和内控下游引物：5’-GCTCCTCCCACACCAGCTTTG-3’。3.一种检测MTHFR基因多态性的探针组，其特征在于，所述探针组包括：MTHFR基因C677T位点探针：5’-GCCACCCCGAAGCAGGGAGCT-3’。4.如权利要求3所述探针组，其特征在于，所述探针组还包括：内控探针：5’-ATTCGCCCTCTTAATGGGGAGG-3’。5.一种用于检测MTHFR基因多态性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物组。6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括权利要求3所述的探针组。7.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括独立分装的第一引物探针混合液和第二引物探针混合液，其中，所述第一引物探针混合液包括：MTHFR基因C677T位点的上游引物：5’-GAGGCCAGCCTC...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋析文，朱小亚，徐小解，
申请(专利权)人：中山大学达安基因股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44