高灵敏酸碱探针、其制备及生物检测应用制造技术

本发明专利技术涉及高灵敏酸碱探针、其制备及生物检测应用。本发明专利技术的高灵敏酸碱探针具有下式I所示的结构。本发明专利技术的高灵敏酸碱探针可用于测量溶液或细胞生物体系内的微小pH波动(0.1‑0.2pH)，可用于癌组织逆转pH梯度成像，选择性的点亮癌组织细胞间质，有效区分癌组织和正常组织，用于癌症部位诊断和辅助荧光手术治疗。

High Sensitive Acid-Base Probe, Its Preparation and Bioassay Application

【技术实现步骤摘要】
高灵敏酸碱探针、其制备及生物检测应用
本专利技术涉及高灵敏酸碱探针、其制备及生物检测应用。
技术介绍
真核细胞内含有高度区分的各种膜包裹结构亚细胞器结构，他们之间的相对独立性保证了行使各自功能时所需要的最佳环境，同时也可以将能量以跨膜电势梯度的形式储存起来。在这一过程中，质子(或者质子平衡)起到了非常关键的作用。例如几乎所有的蛋白质结构和功能都受到pH的调节，质子化-去质子化过程预示着生物表面电荷的改变，是很多代谢反应不可或缺的部分。质子驱动力也是细胞能量产生和转化的关键，因此细胞内的pH总是被严格调控，并且在各个亚细胞器中各有不同。无数具有重要生理活性的蛋白质都对其周围pH的微小变化高度敏感，0.2-0.3个pH单位的改变就能极大的影响生物机体的功能。例如Na+/H+转运蛋白(NHE1)的过度活化会使得细胞内pH增加0.2-0.7个pH单位，诱导细胞增值等转化活动。细胞凋亡也伴随着细胞质pH的轻微酸化现象，大约为0.3-0.4个pH单位，既是正常组织的重要生理特点同时也是诸多治疗的靶标。细胞质pH和亚细胞器pH的失调会影响基因表达、诱导蛋白质折叠、影响酶活性，带来代谢紊乱和遗传扰动等严重问题，最终导致各种疾病的发生。失调的pH已经成为大部分实体瘤的一个重要标志。由于癌细胞细胞质膜上的转运蛋白表达量和活性升高，尤其是外排H+的转运蛋白，因此与正常细胞外碱内酸的情况相反，癌细胞细胞内的pHi≥7.4，而细胞外的pHe为6.7-7.1。这一逆转的pH梯度为癌细胞的转移提供了温床，升高的pHi促进了癌细胞增值和凋亡逃逸，加速了癌细胞新陈代谢适应性和对机体的入侵，同时加速了癌细胞的转移。由于pH失调是癌症的一个通用特点，因此这一细胞内外逆转的pHi/pHe梯度可以作为癌症诊断的标志及癌症治疗的靶标。由于细胞内外的精准pH调节对于各种细胞功能和生理过程非常重要，因此精确监测细胞pH具有相当重要的意义。和核磁共振或者微电极测量pH的手段相比，荧光显微学非侵入式的实时检测具有非常大的优势，能够以高时空分辨率对活体组织的pH扰动进行准确的测量，为研究生物体的生理和病理过程提供了非常重要的信息。小分子荧光探针、高分子聚合物、纳米材料和绿色荧光蛋白是应用的较多的荧光手段，其中小分子荧光探针结构丰富便于修饰，尺寸小且便于调节，能够以自由扩散的方式进入细胞内，因而受到了广泛的关注。虽然已经有大量的小分子荧光探针应用于生物体内pH的测定，这些探针的酸碱滴定曲线均满足经典的酸碱平衡Henderson-Hasselbalch方程，但这类探针的响应范围是2个pH单位，无法实时高效的对微小pH扰动进行识别与监测。在检测条件相同的情况下，Hill-type探针能够对微小的pH改变给出更加明显的信号响应，使得测量更加准确，在生物医学基础研究及临床应用均有重要潜力。
技术实现思路
本专利技术第一方面提供一种具有下式I结构的化合物：式中，R1和R2各自独立为H和C1-C6烷基，或者R1与R2连接在一起成为C2-C6亚烷基；R3和R4各自独立为H和C1-C6烷基，或者R3与R4连接在一起成为C2-C6亚烷基；R5和R6各自独立为H和C1-C6烷基；R7为H、卤素、-CN、-NO2、C1-C6烷基、OR8或NRaRb，其中，R8、Ra和Rb各自独立为H和C1-C6烷基。在一个或多个实施方案中，R1和R2均为C1-C4烷基。在一个或多个实施方案中，R3和R4均为C1-C4烷基。在一个或多个实施方案中，R1与R2连接在一起成为C2-C4亚烷基，R3与R4连接在一起成为C2-C4亚烷基。在一个或多个实施方案中，R5和R6均为C1-C4烷基。在一个或多个实施方案中，R7为NRaRb，其中，Ra和Rb均为C1-C4烷基。在一个或多个实施方案中，R8为C1-C4烷基。在一个或多个实施方案中，R1和R2均为C1-C4烷基；R3和R4均为C1-C4烷基；和R5和R6均为C1-C4烷基。在一个或多个实施方案中，R1和R2均为C1-C4烷基；R3和R4均为C1-C4烷基；和R5和R6均为C1-C4烷基；R7为H、卤素、-CN、-NO2、C1-C6烷基、OR8或NRaRb；其中，R8为H或C1-C4烷基，Ra和Rb均为H或C1-C4烷基。在一个或多个实施方案中，R1和R2均为C1-C4烷基；R3和R4均为C1-C4烷基；和R5和R6均为C1-C4烷基；R7为NRaRb；其中，Ra和Rb均为C1-C4烷基。在某些实施方案中，本专利技术式I化合物选自：本专利技术还提供一种组合物，所述组合物含有本文所述的化合物。在一个或多个实施方案中，所述组合物为所述化合物的PBS溶液或DMSO水溶液。在一个或多个实施方案中，所述组合物为含有所述化合物的细胞培养基。本专利技术还提供本文所述的式I化合物的制备方法，所述方法包括使本文所述的式II化合物与下式III化合物在溶剂中在0℃以下进行反应的步骤：式III中，R5和R6各自独立为H和C1-C6烷基；R7为H、卤素、-CN、-NO2、C1-C6烷基、OR8或NRaRb，其中，R8、Ra和Rb各自独立为H和C1-C6烷基；本专利技术还提供一种试剂盒，所述试剂盒含有本文所述的化合物或组合物。本专利技术还提供本文所述的式I化合物在制备用于实时监测对象的pH波动或用于癌症诊断的试剂或试剂盒中的应用。附图说明图1：(a)不同pH值下PHX6的紫外可见吸收光谱；(b)不同pH值下533nm处的吸光度(■)以及剂量响应的函数非线性拟合曲线(粉色)；(c)不同pH值下PHX6的荧光发射谱图；(d)不同pH值下575nm处的吸光度(■)以及剂量响应的函数非线性拟合曲线(粉色)；所有的数据均采集自探针的10μM含0.1％DMSO的水溶液。图2：(a)不同pH值下PHX1的紫外可见吸收光谱；(b)不同pH值下533nm处的吸光度(■)以及双相剂量响应函数非线性拟合曲线(粉色)；(c)不同pH值下PHX1的荧光发射谱图；(d)不同pH值下575nm处的吸光度(■)以及双相剂量响应函数非线性拟合曲线(粉色)；内嵌图表示Hill组分(蓝色曲线)和HH组分(绿色曲线)。所有的数据均采集自探针的10μM含0.1％DMSO的水溶液。图3：(a)不同pH值下PHX2的紫外可见吸收光谱；(b)不同pH值下533nm处的吸光度(■)以及双相剂量响应函数非线性拟合曲线(粉色)；(c)不同pH值下PHX2的荧光发射谱图；(d)不同pH值下575nm处的吸光度(■)以及双相剂量响应函数非线性拟合曲线(粉色)；内嵌图表示Hill组分(蓝色曲线)和HH组分(绿色曲线)。所有的数据均采集自探针的10μM含0.1％DMSO的水溶液。图4：(a)不同pH值下PHX3的紫外可见吸收光谱；(b)不同pH值下533nm处的吸光度(■)以及双相剂量响应函数非线性拟合曲线(粉色)；(c)不同pH值下PHX3的荧光发射谱图；(d)不同pH值下575nm处的吸光度(■)以及双相剂量响应函数非线性拟合曲线(粉色)；内嵌图表示Hill组分(蓝色曲线)和HH组分(绿色曲线)。所有的数据均采集自探针的10μM含0.1％DMSO的水溶液。图5：(a)不同pH值下PHX4的紫外可见吸收光谱；(b)不同pH值下533nm处的吸光度(■)以及本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.下式I所示的化合物：

【技术特征摘要】
1.下式I所示的化合物：式中，R1和R2各自独立为H和C1-C6烷基，或者R1与R2连接在一起成为C2-C6亚烷基；R3和R4各自独立为H和C1-C6烷基，或者R3与R4连接在一起成为C2-C6亚烷基；R5和R6各自独立为H和C1-C6烷基；R7为H、卤素、-CN、-NO2、C1-C6烷基、OR8或NRaRb，其中，R8、Ra和Rb各自独立为H和C1-C6烷基。2.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，R1和R2均为C1-C4烷基，和/或，R3和R4均为C1-C4烷基；或R1与R2连接在一起成为C2-C4亚烷基，R3与R4连接在一起成为C2-C4亚烷基；和/或R5和R6均为C1-C4烷基；和/或R7为H、-NO2、OR8或NRaRb，其中，R8、Ra和Rb均为C1-C4烷基。3.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，R1和R2均为C1-C4烷基；R3和R4均为C1-C4烷基；R5和R6均为C1-C4烷基；R7为H、-NO2、OR8或NRaRb；其中，R8为H或C1-C4烷基，Ra和Rb均为H或C1-C4烷基。4.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，R1和R2均为C1-C4烷基；R3和R4均为C1-C4烷基；R5和R6均为C1-C4烷基；和R7为NRaRb；其中，Ra和Rb均为C1-C4烷基。5.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物选自：6.下式II所示的化合物：式中，R1和R2各自独立为H和C1-C6...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨有军，钱旭红，罗潇，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：上海,31