本发明专利技术公开了一种双光子比率型荧光探针精确测量肿瘤细胞中的单胺氧化酶B的制备方法和应用。该探针基于荧光共振能量转移的双光子萘衍生物骨架与对甲氨基酚荧光团连接，引入单胺氧化酶B特异性识别的丙胺单元构成。利用酶促氧化脱氨基反应产生相应的亚胺离子，经水解后消除，重新释放染料羟基，导致荧光发射信号比例性的变化。优势在于，能量供体与受体之间的荧光光谱距离更大，光谱之间的干扰更小，灵敏度更高，有效避免了各种环境条件对分析的干扰。为临床用于检测活体内阿尔兹海默症的重要标志酶提供了潜在工具。
Application of a two-photon ratio fluorescent probe in the detection of monoamine oxidase B
【技术实现步骤摘要】
一种双光子比率型荧光探针在检测单胺氧化酶B中的应用
本专利技术涉及小分子荧光探针鉴定异常的生物酶活性在癌细胞中的位置和表达水平，更具体地说是一种基于荧光共振能量转移的双光子萘衍生物荧光探针对阿尔兹海默症的重要标志物单胺氧化酶B（MAO-B）的检测。
技术介绍
阿尔兹海默症（AD）是老年人中最常见的痴呆症，目前影响全球超过3500万人。特别地，与其相关生物标志物的临床检测对于疾病的早期诊断，治疗和管理具有重要意义。单胺氧化酶B（MAO-B）是线粒体结合的黄素酶,在人脑中高度表达,主要存在于星形胶质细胞，其有助于维持大脑中神经递质的稳态，从而确保适当的神经和行为结果。目前，已经证明MAO-B的过度活化会导致产生过量的神经毒性副产物，如H2O2，从而引发以AD为典型代表的精神疾病和神经退行性疾病。因此，鉴定生物标志酶在神经细胞中的位置和表达水平成为早期病症的诊断和监测治疗的关键，也是当前该研究领域亟需解决的问题之一。目前已经应用了几种成像技术来检测或成像酶，例如磁共振成像（MRI），核成像（包括单光子发射计算机断层扫描（SPECT）和正电子发射断层扫描（PET））以及荧光成像。每一种技术都是不可替代的，具有自己的特征灵敏度，穿透深度和空间分辨率。例如，MRI对活癌细胞中低丰度的酶缺乏足够的特异性和敏感性。SPECT和PET具有高灵敏度和断层扫描能力，但空间分辨率较差（1-2mm）。其他一些检测方法，如使用标记抗体或蛋白质组学方法，可用于检测和跟踪固定细胞中的酶或在体外进行检测，但未能提供活细胞中酶的实时信息。为了克服这些缺点，基于小分子荧光探针的荧光成像技术已被广泛用于可视化和量化活细胞动态过程中，其具有灵敏度高，非破坏性快速分析和实时检测的优势。大多数小分子酶荧光探针是基于探针与酶活性位点的特异性相互作用而设计的，包括催化位点和结合位点。酶具有区分各种底物之间微小差异和催化底物特异性反应的能力，通过将最佳底物基团连接到荧光团来产生基于底物的探针，荧光团在活性酶催化时其光谱性质相应改变。在基于FRET的探针中，荧光团和底物通过酶可水解的识别底物在一定距离内彼此连接，以产生比率型探针，其在底物通过特异性酶催化反应释放后恢复荧光。总之，理想的小分子酶探针在靶酶催化的化学修饰后应产生可检测的荧光变化，本文中，设计并合成了一种新的双光子高效比率型荧光化合物（FTP-B），用于检测生物系统中单胺氧化酶B（MAO-B）的活性。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题：一是提供一种原料廉价易得，合成步骤简单，反应条件温和的荧光探针合成方法。二是提供了一种具有大斯托克斯位移、检测速度快、选择性强、灵敏度高、低细胞毒性，用于检测生物样品、活细胞和动物中的MAO-B的新型比率双光子荧光探针。为了解决上述技术问题，采取的技术方案如下，一种特异性识别MAO-B的比率双光子荧光探针，具有如下分子结构式：上述单胺氧化酶B荧光探针的制备方法如下：1）将1eq的Np-Rhod染料与2.5eq碳酸钾，溶解于无水N，N-二甲基甲酰胺中，然后向混合液中加入3eq的1，3-二溴丙烷，室温下搅拌4h后升温至60℃回流12h。用TCL板监测反应，反应完全后，用二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，减压蒸发，并用硅胶柱进行分离，得到化合物FTP-B1，其结构式如下：2）向1eqFTP-B1的无水N，N-二甲基甲酰胺溶液中加入4eq叠氮化钠和4.2eq碳酸钾，使反应混合物在70℃下搅拌10h。用TCL板监测反应，反应完全后，用二氯甲烷萃取溶液。用无水硫酸钠干燥，有机相减压蒸发。通过硅胶色谱纯化残余物，得到目标探针化合物FTP-B。所述步骤1）中硅胶柱分离洗脱剂配比为甲醇:二氯甲烷=1:120。所述步骤1）中Np-Rhod染料与1，3-二溴丙烷的摩尔比值为1:2.8-3.2，1，3-二溴丙烷可略微过量，保证反应进行完全。所述步骤2）中硅胶柱分离洗脱剂配比为甲醇:二氯甲烷=1:100。所述步骤2）中中间产物FTP-B1与叠氮化钠的摩尔比值为1:3.5-4，其中注意保护基团的活性应将pH调节至中性，有利于提高探针的产率。本专利技术的优点:本专利技术的荧光探针，用肉眼就可以观察到溶液颜色的变化，伴随着紫外灯下同样可以观察到荧光颜色变化，是一种具有生色传感功能的荧光探针。本专利技术的荧光探针通过比率荧光成像可以用作区分正常脑组织和患AD小鼠的脑组织切片。主要用的活细胞为B淋巴细胞。由过表达MAO-B的B淋巴细胞基因进行转染。本专利技术的荧光探针，其本身不发射荧光，在与MAO-B作用后，反应体系在538nm处出现红移荧光峰，同时，452nm处的荧光强度急剧下降，提供可视化的比率荧光信号（I538nm/I452nm），在与MAO-B反应后增加了65倍。本专利技术的荧光探针对单胺氧化酶B的检测表现出很高的灵敏度，具有高光稳定性。荧光强度比（I538nm/I452nm）在反应前8分钟内迅速增加，在约60分钟内获得最大强度。探针溶液荧光强度与MAO-B浓度有很好的线性关系。检出限为10ng/mL。本专利技术pH和温度的适用范围较宽，有利于生命系统中MAO-B的检测。在pH值从5.5到8.5的变化以及温度从25℃到45℃的范围内，都不影响探针分子对MAO-B的检测。本专利技术的荧光探针对MAO-B有很好的选择性和很强的抗干扰能力。可能干扰的离子K+，Na+，Mg2+，Fe3+，Zn2+，Ca2+；氨基酸物质，精氨酸、丝氨酸、谷氨酸半胱氨酸和谷胱甘肽；活性酶物质，酪氨酸酶、羧酸酯酶、亮氨酸氨肽酶、溶菌酶、纤维素酶和单胺氧化酶A的存在不影响探针分子对MAO-B的响应。本专利技术的荧光探针具有较好的疾病模型细胞和组织靶向性、化学稳定性、生物相容性和MAO-B选择性。双光子激光共聚焦成像实验表明该探针具有较好的细胞通透性，对细胞和生物体无毒副作用。因此，本专利技术是一种简单、快速，灵敏的MAO-B特异性检测试剂。在化学分析检测领域具有广阔的应用前景。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步的详细说明。实施例11）化合物FTP-B1的合成：将Np-Rhod染料（1.2mmol，1eq），碳酸钾（3mmol，2.5eq）溶解于20mL无水N，N-二甲基甲酰胺中，然后向混合液中加入1，3-二溴丙烷（3.5mmol，3eq），室温下搅拌4h，后升温至60℃回流12h。用TCL板监测反应，反应完全后，用二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，减压蒸发，并用硅胶柱进行分离，硅胶颗粒大小为200-300目，得到化合物FTP-B1，为淡红色固体，洗脱剂配比为甲醇:二氯甲烷=1:120，产率为80%。2）化合物FTP-B的合成：向10mLFTP-B1（0.85mmol，1eq）的无水N，N-二甲基甲酰胺溶液中加入叠氮化钠（3.4mmol，4eq），碳酸钾（3.6mmol，4.2eq），使反应混合物在70℃下搅拌10h。用TCL板监测反应，反应完全后，用二氯甲烷萃取溶液。用无水硫酸钠干燥，有机相减压蒸发。通过硅胶色谱纯化残余物，硅胶颗粒大小为200-300目，得到目标探针化合物FTP-B，为橙色固体，洗脱剂配比为甲醇:二氯甲烷=1:100，产率为58%。实施例2化合物FTP-B荧光探针随不同MAO-B浓度（0-30U）的I542nm/I448nm本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种如式Ⅰ所示的荧光探针在单胺氧化酶B分子检测中的应用，其特征在于，所述荧光探针用于水环境和细胞中单胺氧化酶B的含量传感检测；所述的传感检测包含目视定性检测，荧光检测，细胞成像检测；
【技术特征摘要】
1.一种如式Ⅰ所示的荧光探针在单胺氧化酶B分子检测中的应用，其特征在于，所述荧光探针用于水环境...
【专利技术属性】
技术研发人员：颜梅，卫先哲，张晶，王建荣，张乐淘，武虹乐，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：山东,37
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。