本发明专利技术公开了一种基于3’‑平末端DNA Y‑结构的电化学传感器及其检测方法来检测雌激素受体(ER)，在ER存在的情况下，它能与修饰在电极表面的DNA Y‑结构中的双链DNA特异性结合，使DNA免受外切酶III的降解。由于DNA Y‑结中含有G‑四联体，在电极表面加入血红素后形成具有辣根过氧化物酶样活性的DNA模拟酶，产生明显的电化学信号，从而实现了ER的定量检测。本发明专利技术能在0.1～200nm范围内检测到ER，检测限(LOD)为0.034nm。本发明专利技术可用于肿瘤细胞内ER的检测，在临床应用中有着重要的前景。
An electrochemical sensor for detecting estrogen receptor and its application
【技术实现步骤摘要】
一种检测雌激素受体的电化学传感器及其应用
本专利技术涉及医学检测
，具体涉及一种检测雌激素受体的电化学传感器及其应用。
技术介绍
雌激素受体(ER)是核受体超家族的成员，它能调节生殖系统的生长和分化，参与各种生理和病理过程的调节。新的研究表明雌激素受体不仅与乳腺癌、卵巢癌和子宫内膜癌等雌激素靶器官的肿瘤发生有关，而且广泛表达于肝癌、胃癌、肺癌和结直肠癌等非靶器官。因此，它是各种肿瘤的潜在标志物，同时也是重要的治疗靶点。因此，ER的检测是癌症早期诊断的有效手段。常规的ER检测主要基于抗体抗原特异性反应，如免疫组化检测、酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫印迹法。然而，这些方法通常需要昂贵的雌激素受体抗体、费力的操作、荧光探针和特殊的仪器，这阻碍了它们在资源有限的地区中的应用。电化学生物传感器具有灵敏度高、成本低、简单易携带等优点，为ER的高精度分析提供了一个有前景的平台。中国专利CN201710364329.X公开了一种用于检测雌激素受体的快速检测试剂盒及其检测方法，用于检测雌激素受体的快速检测试剂盒包括雌激素受体标准品，雌激素受体质控品，浓缩洗涤液，发光底物溶液Ⅰ，发光底物溶液Ⅱ，抗体试剂和磁珠免疫复合物，该专利技术提供的用于检测雌激素受体的快速检测试剂盒具有检测时间短、用量少等优点，但其也有一定的缺点，如抗体较昂贵，不易保存，且灵敏度较低等。针对现有技术的不足，本专利技术提出了一种基于3’-平末端DNAY-结构的电化学传感器及其检测方法来检测ER。
技术实现思路
本专利技术为了克服现有技术的不足，提供一种检测雌激素受体的电化学传感器及其应用。原理如图2所示，通过金-硫键在金电极表面修饰P1。P2和P3可以与P1不完全杂交，而由富含G序列组成的P3可以作为电化学信号探针。具体来说，P3通过与P1和P2的杂交连接到电极表面形成一个3’-平末端稳定的Y结构。当外切酶III被引入体系时，因为ER可以与3’-平末端DNA特异性识别并结合，从而避免了3’-平末端DNA被外切酶III降解。因此，在体系中加入Hemin后，P3富含G序列的DNA形成类似HRP活性的DNAzyme，产生较强的电化学信号。然而，在没有ER的情况下，EXOIII可以降解P1-P3的双链，然后释放富含G区的P3，从而不产生电化学信号。为达到以上技术效果，本专利技术具体方案如下：首先，本专利技术提供一种检测雌激素受体的电化学传感器，该检测器基于3’-平末性DNAY-结构，在ER存在下，它能与修饰在电极表面的DNAY-结构中的DNA特异性结合，使DNA不受外切酶III降解的影响，由于DNAY-结中含有G-四联体，在电极上加入血红素后，形成具有辣根过氧化物酶样活性的DNA模拟酶，会产生明显的电化学信号，从而实现了ER的定量检测。其次，本专利技术提供一种电化学传感器的制备方法，具体方案如下：(1)金电极预处理；a)金电极(φ＝3mm)用氧化铝粉末抛光，得到抛光后的电极；b)将步骤2-a)中抛光后的电极浸泡在水虎鱼溶液[V(H2SO4)：(30％H2O2)＝3：1]中2-20min消除吸附的有机物，并用去离子水彻底清洗；c)再将电极用50％硝酸浸泡10-30min，然后分别用乙醇和去离子水处理电极2-8min，再用氮气吹干后，将电极浸入0.5M硫酸中，用循环伏安法(CV)从0到1.6V进行扫描直到获得稳定的信号；(2)将5-20μL含有0.2μmP1的DNA固定液滴定在预处理的金电极表面，在4℃条件下，孵育8-16小时，P1通过Au-S键组装在电极表面。(3)金电极进一步用1mMMCH溶液处理10-50分钟，然后用DNA杂交缓冲液冲洗；(4)在37℃下，将含有1μmP3(信号探针)和1μmP2的DNA杂交缓冲液滴加在金电极表面1-3h，杂交后，用去离子水彻底冲洗电极，即可制得电化学传感器；优选地，步骤(3)中的处理金电极的时间为30分钟；优选地，步骤(2)中DNA固定液的用量为10μL；优选地，步骤(4)DNA杂交缓冲液中P3和P2的浓度比为1：1；优选地，步骤(4)中DNA杂交缓冲液的用量为10μL。再次，本专利技术提供一种上述电化学传感器在检测雌激素受体方面的应用，具体方法如下：(1)将DNAY结构修饰的金电极浸入含有ER的50-300μLDNA结合缓冲液中37℃浸泡50-100分钟；(2)用PBS对电极进行彻底冲洗，并浸入30-80μl含有2U外切酶III的NEB缓冲液I中，37℃孵育10-50分钟，然后，加入20mmEDTA以终止外切酶III反应后，用PBS缓冲液和去离子水对电极进行冲洗；(3)在室温下将10μl新制备的含25mMHEPEs、100μmHemin、200mMNaCl、12.5mMMgCl2和50mMKCl的Hemin溶液滴到电极表面0.5-2h，随后，使用电极进行测量；(4)电化学检测：电化学阻抗谱(EIS)在5.0mM的[Fe(CN)6]3-/4-含KCl(0.1M)中进行，频率在10-1至105Hz范围内，在含有1.0mMH2O2和0.2mMHQ的5mlPBS(0.1M，PH7.4)中进行差分脉冲伏安法(DPV)，扫描范围为-0.2至0.2v；优选地，步骤(1)中DNA结合缓冲液的体积为150μL；优选地，步骤(1)中浸泡时间为30分钟；优选地，步骤(2)中，NEB缓冲液I的体积为50μl。本专利技术的有益效果本专利技术在靶蛋白保护策略诱导DNAY结构形成的基础上，构建了一个基于DNA模拟酶信号放大策略的高灵敏度肿瘤细胞内ER检测电化学传感器。与现有的方法相比，本专利技术具有以下优点。(1)本专利技术通过靶蛋白保护策略在金电极表面形成DNAY-结构，由于靶蛋白保护策略及DNA-Y结构包含G-四联体，当Hemin溶液滴在电极上时，形成具有辣根过氧化物酶样活性的DNA模拟酶，产生电化学信号用于检测ER。(2)本专利技术创造性的利用靶蛋白保护策略，避免了昂贵抗体的使用和复杂的的标记技术。(3)本专利技术操作简单，可得到广泛应用，本专利技术构建的电化学传感器可广泛应用于临床诊断中的ER检测，在0.1～200nm范围内检测到ER，检测限(LOD)为0.034nm。附图说明图1为信号探针Probe1(P1)、Probe2(P2)和Probe3(P3)的碱基序列示意图。图2为电化学传感器的工作原理示意图。图3为实施例3中用于不同修饰电极的EIS测量的奈奎斯特图。图4为实施例4中电化学传感器的可行性结果图。图5为实施例5中条件优化结果图。图6为实施例6在改进电极上获得的差分脉冲伏安(DPV)曲线示意图。图7为实施例7中生物传感器的选择性结果图。图8为实施例8中细胞内ER检测结果图。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利技术作进一步说明。本专利技术所用试剂：人重组ER购自Initrogen(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)；EXOIII和NEBbuffERI是从新英格兰生物实验室(美国华盛顿州伊普斯维奇)获得的；巯基乙醇、硫酸、过氧化氢(H2O2)、Hemin、EDTA和Tris(2-羧基乙基)膦盐酸盐购自SigmaAldrich。所有寡核苷酸序列均由上海桑贡生物技术有限公司(中国上海)合成，并在-20℃下储存在Te缓冲液中；所有其他试剂均为分析试剂级，并在收到时使用。所有缓冲液均用去离子水制本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测雌激素受体的电化学传感器，其特征在于:该检测器基于3’‑平末端DNA Y‑结构，在ER存在下，它能与修饰在电极表面的DNA Y‑结构中的DNA特异性结合，使DNA不受外切酶III降解的影响，由于DNA Y‑结中含有G‑四联体，在电极上加入血红素后，形成具有辣根过氧化物酶样活性的DNA模拟酶，会产生明显的电化学信号，从而实现了ER的定量检测。
【技术特征摘要】
1.一种检测雌激素受体的电化学传感器，其特征在于:该检测器基于3’-平末端DNAY-结构，在ER存在下，它能与修饰在电极表面的DNAY-结构中的DNA特异性结合，使DNA不受外切酶III降解的影响，由于DNAY-结中含有G-四联体，在电极上加入血红素后，形成具有辣根过氧化物酶样活性的DNA模拟酶，会产生明显的电化学信号，从而实现了ER的定量检测。2.一种如权利要求1所述的电化学传感器的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：(1)金电极预处理；(2)将5-20μL含有0.2μmP1的DNA固定液滴定在预处理的金电极表面，在4℃条件下，孵育8-16小时，P1通过Au-S键组装在电极表面；(3)金电极进一步用1mMMCH溶液处理10-50分钟，然后用DNA杂交缓冲液冲洗；(4)在37℃下，将含有1μmP3(信号探针)和1μmP2的DNA杂交缓冲液滴加在金电极表面1-3h，杂交后，用去离子水彻底冲洗电极，即可制得电化学传感器。3.如权利要求2所述的电化学传感器的制备方法，步骤(1)金电极预处理，具体包括如下步骤：a)金电极用氧化铝粉末抛光，得到抛光后的电极；b)将步骤a)中抛光后的电极浸泡在水虎鱼溶液中2-20min消除吸附的有机物，并用去离子水彻底清洗；c)再将电极用50％硝酸浸泡10-30min，然后分别用乙醇和去离子水处理电极2-8min，再用氮气吹干后，将电极浸入0.5M硫酸中，用循环伏安法(CV)从0到1.6V进行扫描直到获得稳定的信号。4.如权利要求2所述的电化学传感器的制备方法，其特征在于：步骤(2)中DNA固定液的用量为10...
【专利技术属性】
技术研发人员：李金龙，张永臣，胡亮，许传军，胡凯，张兆利，
申请(专利权)人：南京市第二医院，南京鼓楼医院，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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