本发明专利技术基于功能化的纳米磁珠和核酸外切酶III辅助的放大策略构建了一种用于检测端粒酶活性的电化学传感器及其检测方法，实现了对肿瘤细胞端粒酶活性的检测。在本发明专利技术中，互补的探针可以与延长的端粒酶引物重复序列杂交，杂交产物通过磁珠分离，端粒酶引物重复序列链被核酸外切酶Ⅲ识别和降解，释放的互补探针能够杂交并打开多个亚甲基蓝标记的发夹DNA探针，经过核酸外切酶III的二次降解后，互补探针又可以进入下一个与MB标记的发夹样结构杂交的循环，而MB标记的探针与金电极表面的捕获探针结合，从而产生与端粒酶活性呈正比的峰电流值，本发明专利技术的电化学传感器及其检测方法能够在单细胞水平检测端粒酶活性。
An electrochemical sensor for detecting Telomerase activity and its detection method
【技术实现步骤摘要】
一种用于检测端粒酶活性的电化学传感器及其检测方法
本专利技术涉及端粒酶电化学检测领域，特别是涉及一种基用于检测端粒酶活性的电化学传感器及其检测方法。
技术介绍
端粒末端转移酶，简称端粒酶，最初是在单细胞生物(四膜虫)中发现的，端粒酶是一种核糖核蛋白逆转录酶，能够将TTAGGG重复序列加到染色体DNA的端粒末端。发现近十年后，端粒酶被认为是人类癌症的一个普遍的生物标志物，众所周知，随着年龄的增加，端粒逐渐缩短，通过激活或上调端粒酶等一系列的变化，具有短端粒的细胞逃避衰老成为永生细胞。大多数人类肿瘤细胞(85％–90％)高表达端粒酶，而在大多数正常组织或者细胞端粒酶活性是缺失的或被高度抑制的，使端粒酶成为癌症治疗的一个有吸引力的目标和肿瘤早期诊断的一种有价值的肿瘤标志蛋白。研究表明端粒酶的异常表达在肝癌的发生、发展过程中起着关键作用，研究者对肝癌组织端粒酶活性的体外研究表明，肝癌中端粒酶阳性率明显高于慢性肝炎组织、肝硬化组织和癌旁组织，而正常肝组织并没有端粒酶活性，因此端粒酶的检测对于肝癌的早期诊断、治疗具有重要意义。迄今为止，研究者已开发出多种端粒酶活性检测的方法，在这些方法中，以端粒重复扩增序列(TRAP)为基础的聚合酶链式反应(PCR)被认为是最广泛使用的方法。然而，许多细胞裂解物中含有TaqDNA聚合酶的抑制剂，这可能会导致假阴性结果。因此，近年来发展了很多PCR的替代方法，包括比色法、荧光法、化学发光法，电化学方法和表面等离子共振法等，其中电化学方法具有微型化和高灵敏度的优点，在实际应用中具有显著的优越性。如中国专利CN201510346698.7公开了一种用于检测端粒酶活性的电化学传感器及其制备方法，该电化学传感器制备的主要过程是，在二硫化钼纳米片表面依次吸附硫堇、Au@SiO2、富G结构的DNA链S1，通过加入Hemin形成MoS2-Thi-Au@SiO2/DNAzyme纳米复合材料，在金电极表面修饰TS前体，利用端粒酶延长DNA链形成S2，并与S1互补螺旋，最终通过检测催化过氧化氢氧化ABTS的电化学信号强弱来实现对端粒酶活性的直接检测，该专利技术制备的电化学传感器操作简单，灵敏度高，稳定性强。再如中国专利CN201710857470.3公开了一种基于电化学发光级联放大原理的端粒酶活性检测方法，本专利技术利用端粒酶能执行添加重复序列的性能，结合电化学发光放大信号基团线性及树状三联吡啶钌聚合物电化学发光方法，提出了基于电化学发光级联放大原理的高灵敏度端粒酶活性检测方法，该专利技术检测过程简单、快速，经过简单的端粒酶提取过程即可进行端粒酶活性监测，耗时短，省去了扩增步骤，检测快速，同时成本低。尽管使用不同的电化学方法来检测端粒酶活性已经取得了巨大的进步，但在电极表面，端粒酶对引物的识别能力有限，电极表面的空间位阻效应使得这些非均相实验的结合效率和酶动力学相对较低。同时由于细胞裂解液中含有多重酶蛋白，容易对端粒酶的延伸产物产生降解作用，不利于端粒酶活性的真实检测。本专利技术基于磁珠(Magneticbeads,MB)和核酸外切酶III辅助的信号放大策略提出了一种均相、简单、快速、高灵敏用于检测端粒酶活性的电化学传感器和检测方法。
技术实现思路
针对上述现有技术的不足，本专利技术的第一个目的在于提供一组用于检测端粒酶活性的探针，具体序列如下：端粒酶底物(TS)引物,SEQIDNO.1：5′-NH3-TTTTTTTTTTAATCCGTCGAGCAGAGTT-3′；发夹样探针(HP)，SEQIDNO.2：5′-MB-TTTGTACCCTTTTGTGAGTTGGTTAGGGTTAGGG-3′；捕获探针(DNAS1)，SEQIDNO.3：5′-GGTACATT-SH-3′；互补探针，SEQIDNO.4：5′-CCCTAACCCTAA-3′。本专利技术的第二个目的在于提供一种用于检测端粒酶活性的电化学传感器。具体方案如下：1.细胞培养及端粒酶的提取(1)HeLa细胞培养；(2)细胞悬浮分散处理：将处在对数生长期的细胞用PBS洗涤，用胰蛋白酶消化1-3min后，再用PBS缓冲液吹打细胞，使其脱离，制得脱壁细胞；(3)端粒酶提取：收集步骤(2)制得的脱壁细胞，离心、重悬并冰浴10-50min，将含有细胞的裂解液在4℃的温度下离心，收集上清液，测定蛋白浓度，所提取物立即使用或储存在-80℃；2.金电极处理和DNA的固定(1)金电极预处理：a)金电极用各种粒子大小的(1.0、0.3和0.05μm)氧化铝粉末抛光，得到抛光后的电极；b)将步骤2-a)中抛光后的电极浸泡在水虎鱼溶液[V(H2SO4)：(30％H2O2)＝3：1]中2-20min消除吸附的有机物，并用去离子水彻底清洗；c)再将电极用50％硝酸浸泡10-30min，然后，分别用乙醇和去离子水处理电极2-8min，再用氮气吹干后，将电极浸入0.5M硫酸中，用循环伏安法(CV)从0到1.6V进行扫描直到获得稳定的信号；(2)将含巯基标记捕获探针的DNA固定化缓冲液滴加在金电极表面，在潮湿条件下孵育8-16h，捕获探针一端的巯基通过Au-S键连接到金电极表面，然后对修饰的金电极进行冲洗，在电极表面滴入含1mMMCH的Tris-HCl，孵育8-20min；(3)将没有被捕获探针结合的金电极表面封闭起来，以形成良好的无非特异性吸附的自组装单分子层；3.端粒酶活性的电化学检测(1)将10μL步骤1-(3)中的提取物添加到40μL含有2mM互补探针的延伸溶液中，在37℃反应2h，制得磁珠-DNA复合物；(2)将步骤3-(1)制得的磁珠-DNA复合物收集，用PBS冲洗，然后加入反应缓冲液，重悬磁珠(MB)-DNA复合物，并加入发夹样探针(HP)，核酸外切酶III(ExonucleaseIII,ExoIII)，在25℃孵育20-60min，制得混合物；(3)将步骤3-(2)制得的混合物与捕获探针修饰的金电极共孵育1-4h，之后彻底清洗去除多余的DNA，制得电化学传感器，即可对端粒酶活性进行电化学检测；优选地，步骤1-(1)中，HeLa细胞培养的条件为：37℃，5％CO2培养条件下用含有10％胎牛血清的DMEM培养基培养；优选地，步骤1-(3)中，首次离心为1000rpm离心5min；优选地，步骤1-(3)中，冰浴时间为30min；优选地，步骤1-(3)中，第二次离心为12000rpm离心30min；优选地，步骤1-(3)中，用200μL冰冻的1×CHAPS裂解缓冲液重悬；优选地，步骤1-(3)中，用Eppendorf管收集上清液；优选地，步骤2-(2)中，用1μM的巯基标记捕获探针；其中，步骤2-(1)-a)中，氧化铝粉末的粒子大小可以为1.0、0.3和0.05μm；优选地，步骤2-(2)中，在潮湿条件下孵育12h；优选地，步骤2-(2)中，在电极表面滴入含1mMMCH的10μLTris-HCl(10mM)，孵育15min；优选地，步骤3-(1)中延伸液的成分为：20mMTris-HCl,pH8.3,1.5mMMgCl2,63mMKCl,0.005％Tween20,1mMEGTA,0.1mg·mL-1BSA,1mMdNTP和0.5μM磁珠-Primer；其中，步骤3-(1)中，提取物和延伸液本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一组用于检测端粒酶活性的探针，其特征在于，具体序列如下：端粒酶底物(TS)引物,SEQ ID NO.1：5′‑NH3‑TTTTTTTTTTAATCCGTCGAGCAGAGTT‑3′；发夹样探针(HP)，SEQ ID NO.2：5′‑MB‑TTTGTACCCTTTTGTGAGTTGGTTAGGGTTAGGG‑3′；捕获探针(DNA S1)，SEQ ID NO.3：5′‑GGTACATT‑SH‑3′；互补探针，SEQ ID NO.4：5′‑CCCTAACCCTAA‑3′。
【技术特征摘要】
1.一组用于检测端粒酶活性的探针，其特征在于，具体序列如下：端粒酶底物(TS)引物,SEQIDNO.1：5′-NH3-TTTTTTTTTTAATCCGTCGAGCAGAGTT-3′；发夹样探针(HP)，SEQIDNO.2：5′-MB-TTTGTACCCTTTTGTGAGTTGGTTAGGGTTAGGG-3′；捕获探针(DNAS1)，SEQIDNO.3：5′-GGTACATT-SH-3′；互补探针，SEQIDNO.4：5′-CCCTAACCCTAA-3′。2.一种用于检测端粒酶活性的电化学传感器的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：(1)细胞培养及端粒酶的提取；(2)金电极处理和DNA的固定；(3)端粒酶活性的电化学检测。3.如权利要求2所述的一种制备方法，其中步骤(1)细胞培养及端粒酶的提取，具体步骤如下：1)HeLa细胞培养；2)细胞悬浮分散处理：将处在对数生长期的细胞用PBS洗涤，用胰蛋白酶消化1-3min后，再用PBS缓冲液吹打细胞，使其脱离，制得脱壁细胞；3)端粒酶提取：收集步骤(2)制得的脱壁细胞，离心、重悬并冰浴10-50min，将含有细胞的裂解液在4℃的温度下离心，收集上清液，测定蛋白浓度，所提取物立即使用或储存在-80℃。4.如权利要求2所述的一种制备方法，其中步骤(2)金电极处理和DNA的固定，具体步骤如下：1)金电极预处理：a)金电极用氧化铝粉末抛光，得到抛光后的电极；b)将步骤2-a)中抛光后的电极浸泡在水虎鱼溶液[V(H2SO4)：(30％H2O2)＝3：1]中2-20min消除吸附的有机物，并用去离子水彻底清洗；c)再将电极用50％硝酸浸泡10-30min，然后分别用乙醇和去离子水处理电极2-8min，再用氮气吹干后，将电极浸入0.5M硫酸中，用循环伏安法(CV)从0到1.6V进行扫描直到获得稳定的信号；2)将含巯基标记捕获探针的DNA固定化缓冲液滴加在金电极表面，在潮湿条件下孵育8-16h，捕获探针一端的巯基通过Au-S键连接到金电极表面，然后对修饰的金电极进行冲洗，在电极表面滴入含1mMMCH的Tris-HCl，孵育8-20min；3)将没有被捕获探针结合的金电极表面封闭起来，以形成良好的无非特异性吸附的自组装单分子层。5.如权利要求2所述的一种制备方法，其中步骤(3)端粒酶活性的电化学检测，具体步骤如下：1)将10μL端粒酶提取物添加到40μL含有2mM互补探针的延伸溶液中，在37℃反应2h，制得磁珠-DNA复合物；2)将步骤1)制得的磁珠-DNA复合物收集，用PBS冲洗，然后加入反应缓冲液，重悬磁珠(MB)-DNA复合物，并加入发夹样探针(HP)，核酸外切酶III(E...
【专利技术属性】
技术研发人员：李金龙，杨永峰，张永臣，许传军，胡凯，
申请(专利权)人：南京市第二医院，南京鼓楼医院，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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