一种用于土霉素检测的适配体电化学传感器的制备方法，所述适配体电化学传感器采用三电极系统，其工作电极的制备方法包括下述步骤：电极预处理，4‑羧基苯基重氮盐的修饰，羧基活化，适配体共价修饰等。然后将制备好的适配体电化学传感器利用差分脉冲伏安法制作标准曲线，最后根据土霉素标准曲线实现对样品中土霉素的测定。本发明专利技术可以实现土霉素的高灵敏高选择性检测，适配体通过共价结合的方式固定，有效提高传感器的性能，可以实现样品中土霉素的快速检测，具有很好的应用前景。
Preparation of an adaptor electrochemical sensor for oxytetracycline detection
【技术实现步骤摘要】
一种用于土霉素检测的适配体电化学传感器的制备方法
本专利技术涉及电化学
、食品安全检测
，特别涉及一种用于土霉素检测的适配体电化学传感器的构建及应用。
技术介绍
电化学生物传感器作为一种新型检测技术，具有灵敏度高，设备简单，成本低，检测目标范围广，响应速度快等特点，因此其在环境检测，食品和药物分析领域具有广泛的应用。核酸适配体是能与目标物特异性结合的短单链DNA或者RNA寡核苷酸，它可以作为电化学生物传感器的敏感识别元件，与特定靶物质进行结合，构建适配体电化学生物传感器。土霉素（Oxytetracycline，OTC）是四环素类抗生素中的一种，在农业、畜牧业和水产养殖业的广泛使用，动物源性食品中土霉素的残留对人体健康造成严重危害。基于土霉素的理化性质，目前传统的抗生素残留检测方依赖于大型仪器进行分析检测，仪器价格昂贵，需要复杂的样品前处理过程及专业的操作人员。因此，开发简便快捷、灵敏可靠且可用于检测食品中土霉素的快速检测具有十分重要的意义。作为敏感识别元件，如何将适配体很好地固定在电极表面上将直接影响适配体电化学传感器的稳定性、再现性和灵敏度。现今报道的适配体电化学传感器中，常常采用吸附法将适配体固定在传感器的功能界面。吸附法的优点是方法简单、反应条件温和，缺点是适配体和固体表面之间的结合力很弱，所以使得在检测过程中适配体容易从电极表面脱离，从而难以实现对目标物的检测。而适配体通过共价键结合固定在电极表面可以大大提高适配体电化学传感器性能，增加传感器的稳定性和可重复性。因此，探索通过共价键结合法构建的适配体电化学适配体传感器至关重要。专利技术内容本专利技术旨在提供一种检测土霉素的适配体电化学传感器的构建方法及其在食品安全检测领域的应用。所述适配体电化学传感器构建过程中适配体是通过共价结合的方式固定于传感器的传感功能界面。本专利技术提供一种适配体电化学传感器及制备方法，其目的是解决通过吸附法制备的适配体电化学传感器的稳定性差，可重复性差的问题。为达到上述目的，本专利技术的技术方案是这样实现的：用于土霉素检测的适配体电化学传感器的传感功能界面的构建策略是，先在玻碳电极（GCE）表面修饰4-羧基苯基重氮盐（4-CP），得到4-CP/GCE，是电极表面带有羧基，用EDC和NHS的混合溶液对电极表面的羧基进行活化，得到羧基活化电极（act/4-CP/GCE），然后将带有氨基的土霉素适配体滴涂在电极表面，孵育一段时间使其共价结合到电极表面，得到适配体修饰电极（apt/act/4-CP/GCE）。然后将制备好的适配体修饰电极接入三电极体系对土霉素的浓度进行测定。进一步，所述适配体序列为：5'-氨基-C3-GGAATTCGCTAGCACGTTGACGCTGGTGCCCGGTTGTGGTGCGAGTGTTGTGTGGATCCGAGCTCCACGTG-3'。一种用于土霉素检测的适配体电化学传感器的制备方法，包括如下步骤：（1）电极的预处理。将玻碳电极用粒径为0.05μm氧化铝粉末抛光并用超纯水冲洗抛光的玻碳电极3~5次；通过循环伏安法在0.1mol/LKCl和5mmol/L[Fe(CN)6]3-/4-的混合溶液中测试电极的性能，扫描速度为100mV/s，扫描范围为-0.2~0.6V；如果循环伏安法中两个峰之间的差值小于120mV，则证明电极可以继续使用，如果两个峰之间的差值大于120mV，则需要根据上述要求进一步处理电极，电极处理完后用氮气吹干备用。（2）4-CP/GCE的制备：400μL的0.1mol/LNaNO2溶液（终浓度2mmol/L）加入到20mL含有2mmol/L4-氨基苯甲酸和0.5mmol/LHCl的溶液中成为混合溶液。将混合溶液充分震荡并且放置在室温下反应约5分钟，生成4-羧基苯基重氮盐（4-CP），然后吸取20μL4-羧基苯基重氮盐溶液，滴涂在GCE表面，将修饰电极放置于在真空干燥箱中干燥20min，得到4-羧基苯基重氮盐修饰的GCE（4-CP/GCE）。（3）4-CP/GCE的羧基活化：取20μL0.1mol/LEDC和NHS的混合溶液，滴定在修饰好的电极表面（4-CP/GCE），活化电极表面的羧基得到act/4-CP/GCE，反应60min后，用超纯水冲洗电极表面2~3次。（4）apt/act/4-CP/GCE的制备：将20μL带氨基的土霉素适配体（2μmol/L）滴涂在电极表面，，4℃下孵育12h后，冲洗电极表面以除去未与电极表面结合的适配体，然后滴加20μL乙醇胺（1mol/L），1h后用超纯水冲洗2~3次，滴定20μLBSA（1%），室温下放置1h同样用超纯水冲洗电极表面，得到适配体修饰电极（apt/act/4-CP/GCE）。进一步，本专利技术还提供一种适配体电化学传感器检测土霉素的方法，包括以下步骤：（1）制作标准曲线：制备好的apt/act/4-CP/GCE作为工作电极放入不同浓度的土霉素标准品溶液中孵育1h，置于含5.0mmol/L[Fe(CN)6]3-/4-和0.1mol/LKCl的水溶液中通过差分脉冲伏安法（DPV）进行测定，记录下电流响应值，得到土霉素浓度的对数与电流响应值呈线性关系标准曲线；（2）测定样品土霉素浓度：利用制备好的apt/act/4-CP/GCE放入经过样品前处理的样品溶液中孵育1h，通过DPV检测电极，记录电流响应值，然后根据步骤（1）获得的标准曲线，即可计算出样品中土霉素的浓度。4-羧基苯基重氮盐修饰的玻碳电极的英文缩写是4-CP/GCE；玻碳电极的英文缩写是GCE；4-羧基苯基重氮盐的英文缩写是4-CP；羧基活化修饰电极的英文缩写是act/4-CP/GCE；适配体修饰电极的英文缩写是apt/act/4-CP/GCE。EDC是1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐；NHS是N-羟基丁二酰亚胺。BSA是牛血清白蛋白的英文缩写。相比现有技术，本专利技术具有如下有益效果：（1）本专利技术构建的适配体电化学传感器采用共价键结合法，引入活性基团羧基，与适配体上的氨基形成酰胺键，将适配体很好的联结到电极表面，提高了适配体电化学传感器的稳定性和重现性。（2）本专利技术中的适配体电化学传感器用于对兽药残留土霉素进行检测，采用三电极系统，通过差分脉冲伏安法，可以得到电流与土霉素浓度之间的线性关系标准曲线，并在该标准曲线的基础上，可利用标准曲线法对样品中土霉素含量进行计算，检测结果灵敏度和精度高，稳定性和可重复性好，操作简单，检测速度快，可以实现食品样品中土霉素的快速检测。（3）采用本专利技术检测方法无需使用大型仪器，可精准地检测食品样品中的土霉素残留含量，可实现高灵敏，高选择性地检测，具有良好的应用前景。附图说明图1为本专利技术实施例所述的土霉素适配体电化学传感器构建过程的循环伏安表征；图2为本专利技术实施例所述土霉素适配体传感器构建过程的交流阻抗图谱；图3为本专利技术实施例所述所构建适配体电化学传感器随土霉素浓度变化的DPV响应曲线；图4为本专利技术实施例所述所构建适配体电化学传感器检测土霉素的标准曲线；图5为本专利技术实施例所述的适配体电化学传感器的特异性实验。具体实施方式实施例1本专利技术提供一种土霉素适配体电化学传感器的构建方法，具体构建步骤如下：（1）电极的预处理。用粒径为0.05μm氧化铝本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于土霉素检测的适配体电化学传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）GCE的预处理：用粒径为0.05 μm氧化铝粉末抛光，用超纯水冲洗抛光的玻碳电极3~5次，清洗后，通过循环伏安法在0.1 mol/L KCl和5 mmol/L [Fe(CN)6]
【技术特征摘要】
1.一种用于土霉素检测的适配体电化学传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）GCE的预处理：用粒径为0.05μm氧化铝粉末抛光，用超纯水冲洗抛光的玻碳电极3~5次，清洗后，通过循环伏安法在0.1mol/LKCl和5mmol/L[Fe(CN)6]3-/4-的混合溶液中测试电极的性能，扫描速度为100mV/s，扫描范围为-0.2~0.6V；如果循环伏安法中两个峰值之间的差值小于120mV，则证明电极可以继续使用；（2）4-CP/GCE的制备：将400μL的0.1mol/LNaNO2溶液加入到20mL含有2mmol/L4-氨基苯甲酸和0.5mmol/LHCl的溶液中成为混合液；将混合液充分震荡并且放置在室温下反应约5分钟，生成4-CP溶液，然后吸取20μL4-CP滴涂在GCE表面，将修饰电极放置于在真空干燥箱中干燥20min，得到4-CP/GCE；（3）act/4-CP/GCE的制备：取0.1mol/LEDC和0.1mol/LNHS的混合溶液20μL，滴定在4-CP/GCE表面以活化电极表面，得到act/4-CP/GCE，反应60min后，用超纯水冲洗电极表面2~3次；（4）apt/act/4-CP/GCE的制备：将20μL且2μmol/L带氨基的土霉素适配体滴涂在电极表面，4℃下孵育12h后，冲洗电极表面，然后滴加20μL1mol/L乙醇胺，1h后用超纯水冲洗2~3次，滴定20μL浓度是1%BSA，室温下放置1h，用超纯水冲洗电极表面，得到apt/act/4-C...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨钰昆，张锦华，王小敏，郭彩霞，尉立刚，张国华，范三红，
申请(专利权)人：山西大学，
类型：发明
国别省市：山西,14
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