结合CD73的抗体-药物偶联物制造技术

本发明专利技术公开了一种新的靶向于CD73的抗体‑药物偶联物。本发明专利技术还公开了制备抗体‑药物偶联物的方法和用途。本发明专利技术的抗体‑药物偶联物能够高特异性地结合CD73蛋白和多种CD73激活表达的肿瘤细胞，其具有很高的亲和力、很低的免疫原性，进而通过CD73特异性细胞毒药物发挥抗肿瘤作用。

Antibody-drug conjugates binding to CD73

【技术实现步骤摘要】
结合CD73的抗体-药物偶联物
本专利技术涉及医药领域，尤其涉及靶向CD73的抗体及抗体-药物偶联物、以及制备方法和用途。
技术介绍
CD73是一种分子量为70Kd的胞外5-核酸酶(NT5E)，被糖磷脂酰肌醇(GPI)锚定于细胞表面。生理状态下，CD73主要表达于多种组织，如大肠，肾脏，肝脏，肺，淋巴结等组织。细胞外释放的ATP/ADP经CD39水解产生的腺苷单磷酸(AMP)或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)经一系列代谢产生的AMP，在CD73的催化作用下脱去磷酸基团生成大量的腺苷(Adenosine,ADO)暴露在组织周围，后者通过结合相应的腺苷受体(A1AR、A2AR、A2BR、A3AR)参与细胞多种生理进程。研究表明，CD73及腺苷通路与肿瘤的发生和发展密切相关。首先，其能够促进肿瘤发生免疫逃逸。低氧，炎症因子(IFN-γ、TNF-α、IL-1β、TGF-β等)及相关信号通路(Wnt,cAMP)的激活能够诱导肿瘤细胞异常表达CD73，后者通过催化AMP产生大量的ADO，包围在肿瘤周围，形成抗肿瘤免疫抑制的“环”型微环境，促进肿瘤发生免疫逃逸，其主要机制为：1)ADO作用于CD8+T细胞表面腺苷受体(A2AR)，通过cAMP信号通路抑制其增殖，扩增，并且减少相关促炎细胞因子IFN-γ、TNF-α等的释放，从而降低其细胞毒性作用；2)ADO能够干扰NK细胞与肿瘤细胞之间的粘附，从而降低NK细胞胞吐细胞毒性颗粒的能力，细胞毒性作用减弱；3)ADO通过结合调节性T细胞(Tregs)表面的A2AR促进其扩增，增强其免疫抑制及抗炎功能；同时，Tregs表面的CD73催化产生的ADO结合CD8+效应T细胞A2AR抑制NF-kB的激活，导致促炎细胞因子及趋化因子的分泌减少。临床前研究也表明，将来源于野生型小鼠的CD4+CD25+Tregs注入Tregs缺失的小鼠体内将促进结肠癌的发展，而来源于CD73缺陷小鼠的Tregs不产生任何作用，提示CD73及Tregs对肿瘤产生免疫抑制具有重要作用；4)ADO抑制M1型巨噬细胞的分化，减少促炎细胞因子IL-12、TNF-α、iNOS等的释放，其能够激活M2型巨噬细胞，产生大量的抗炎细胞因子(TGF-β,arginase1)，从而帮助肿瘤产生免疫逃逸。其次，CD73能够促进肿瘤的生长和转移进程。临床前研究结果显示，CD73异常表达于多种肿瘤细胞，如乳腺癌，膀胱癌，卵巢癌，结肠癌，非小细胞肺癌等，且临床数据显示高表达CD73与肿瘤病人的不良预后密切相关[ExpertRevAnticancerTher.2017；17:527]，提示CD73可作为多种肿瘤临床治疗及预后靶标。体外研究指出CD73能够促进荷有B16F10黑色素瘤细胞的C57BL/6小鼠新生血管的形成，采用CD73阻滞药物能够显著抑制新生血管的数量及血管床的成熟。另外，CD73产生的ADO能够通过上调细胞周期蛋白D1(CyclinD1)促进微血管内皮细胞的增殖，以及血管内皮生长因子(VEGF)的释放，促进肿瘤血管形成，为肿瘤的生长提供了充足的能量。体内研究表明CD73缺陷的小鼠表现为肿瘤血管的减少，提示靶向CD73有望联合抗血管新生类药物(bevacizumab)，为临床治疗肿瘤提供新的方案。大量研究表明ADO与肿瘤细胞的转移密切相关。通过分析膀胱癌肿瘤样本发现，与非淋巴结转移的肿瘤样本相比，淋巴结转移样本中CD73表达显著升高。Stagg等采用CD73单抗[TY/23]处理小鼠能够有效的抑制4T1.2自发性肺转移，另一项结果也证实了CD73单抗AD2通过促进CD73的聚集和内吞，从而阻止了循环肿瘤细胞建立继发性肿瘤灶，极大程度的限制了肿瘤细胞的渗出和定殖于其他组织的能力。同样，临床数据分析表明高表达的CD73与胃癌，膀胱癌，恶性黑色素瘤等转移密切相关，进一步提示CD73对肿瘤转移具有重要作用。耐药是肿瘤治疗中的一大难题和挑战。研究表明，CD73参与肿瘤化疗，超声治疗，靶向治疗及免疫治疗等的耐药性产生，极大的阻碍了肿瘤治疗的有效性[DiscoveryToday2017；22:1686]。研究表明，采用阿霉素(anthracycline)治疗三阴性乳腺癌(TNBC)病人时，高表达的CD73与病理完全应答率(pCR)密切相关，即低表达CD73的病人呈现出对阿霉素治疗表现出更好的响应，机制研究显示，阿霉素通过上调CD73/CD39表达，抑制CD8+T细胞IFN-γ等分泌，抑制其抗肿瘤免疫作用。采用靶向CD73单抗能够显著增强阿霉素抗肿瘤免疫应答及抗肿瘤活性。此外，在一项曲妥珠单抗(Trastuzumab)治疗Her2+乳腺癌的临床试验中，CD73高表达与不良预后显著相关；靶向CD73单抗联合Trastuzumab可通过增加CD8+T细胞、减少MDSC浸润从而产生协同抗肿瘤作用[CancerRes.2017；77:5652]。抗体-药物偶联物(antibody-drugconjugate，ADC)，是利用单克隆抗体特异性识别肿瘤细胞表面特定抗原的特点，从而实现精准地将抗肿瘤药物(如小分子化疗药物等)递送到肿瘤靶细胞并释放，达到精准杀伤肿瘤的目的。ADC也因为其分子量大小合适，稳定性高，靶向性强，毒副作用小被认为是最具潜力的抗肿瘤药物。但成功开发ADC也存在诸多必须考虑且必须解决的问题，如抗体要特异性的识别病变部位，免疫致敏性低，能够高效迅速的发生细胞内吞作用；抗体-药物接头，在血液中稳定性要高并能在靶向细胞中特异的被激活并高效释放小分子药物；所偶联的小分子药物细胞杀伤能力要强等。临床前研究显示，CD73异常表达于多种肿瘤，如乳腺癌，非小细胞肺癌，膀胱癌，卵巢癌，结肠癌等，且高表达CD73与肿瘤病人的不良预后密切相关[ExpertRevAnticancerTher.2017；17:527]。但是，目前临床上尚缺乏高特异性的针对人CD73的抗体-药物偶联物,因此，迫切需要开发靶向肿瘤CD73的抗体-药物偶联物，将发挥其具有的特点和优势，为治疗CD73异常表达的癌症提供新的思路和前景。
技术实现思路
本专利技术提供了一种靶向人源CD73的抗体，其具有阻断CD73催化腺苷一磷酸(AMP)水解生成腺苷的活性，具有抑制肿瘤生长和转移活性，并可以减少抗肿瘤治疗耐药性的出现。在本专利技术的第一方面，提供了一种抗体的重链可变区，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：SEQIDNO.:10所示的CDR1，SEQIDNO.:11所示的CDR2，和SEQIDNO.:12所示的CDR3；或者，SEQIDNO.:1所示的CDR1，SEQIDNO.:2所示的CDR2，和SEQIDNO.:3所示的CDR3；或者，SEQIDNO.:21的CDR1，SEQIDNO.:22所示的CDR2，和SEQIDNO.:23所示的CDR3，其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留CD73结合亲和力的衍生序列。在另一优选例中，所述重链可变区包括以下互补决定区：SEQIDNO.:10、SEQIDNO.:11、SEQIDNO.:12所示mAb002c的重链互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3；或本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗体‑药物偶联物，其特征在于，所述抗体药物偶联物含有：(a)抗体部分；和(b)与所述抗体部分偶联的偶联部分，所述偶联部分选自下组：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、或其组合；其中，所述抗体的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：SEQ ID NO.:10所示的CDR1，SEQ ID NO.:11所示的CDR2，和SEQ ID NO.:12所示的CDR3；或者，SEQ ID NO.:1所示的CDR1，SEQ ID NO.:2所示的CDR2，和SEQ ID NO.:3所示的CDR3；或者，SEQ ID NO.:21的CDR1，SEQ ID NO.:22所示的CDR2，和SEQ ID NO.:23所示的CDR3，其中，上述重链可变区氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留CD73结合亲和力的衍生序列；和/或所述抗体的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：SEQ ID NO.:13所示的CDR1'，SEQ ID NO.:14所示的CDR2'，和SEQ ID NO.:15所示的CDR3'；或者，SEQ ID NO.:4所示的CDR1'，SEQ ID NO.:5所示的CDR2'，和SEQ ID NO.:6所示的CDR3'；或者，SEQ ID NO.:24所示的CDR1'，SEQ ID NO.:25所示的CDR2'，和SEQ ID NO.:26所示的CDR3'；其中，上述轻链可变区氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留CD73结合亲和力的衍生序列。...

【技术特征摘要】
2018.03.07 CN 20181018835181.一种抗体-药物偶联物，其特征在于，所述抗体药物偶联物含有：(a)抗体部分；和(b)与所述抗体部分偶联的偶联部分，所述偶联部分选自下组：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、或其组合；其中，所述抗体的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：SEQIDNO.:10所示的CDR1，SEQIDNO.:11所示的CDR2，和SEQIDNO.:12所示的CDR3；或者，SEQIDNO.:1所示的CDR1，SEQIDNO.:2所示的CDR2，和SEQIDNO.:3所示的CDR3；或者，SEQIDNO.:21的CDR1，SEQIDNO.:22所示的CDR2，和SEQIDNO.:23所示的CDR3，其中，上述重链可变区氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留CD73结合亲和力的衍生序列；和/或所述抗体的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：SEQIDNO.:13所示的CDR1'，SEQIDNO.:14所示的CDR2'，和SEQIDNO.:15所示的CDR3'；或者，SEQIDNO.:4所示的CDR1'，SEQIDNO.:5所示的CDR2'，和SEQIDNO.:6所示的CDR3'；或者，SEQIDNO.:24所示的CDR1'，SEQIDNO.:25所示的CDR2'，和SEQIDNO.:26所示的CDR3'；其中，上述轻链可变区氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留CD73结合亲和力的衍生序列。2.如权利要求1所述的抗体-药物偶联物，其特征在于，所述抗体药物偶联物ADC如下分子式所示：其中：Ab是抗CD73的抗体，LU是接头(又称连接子)；D是药物；而且下标p是选自1-10，较佳地1-8的值。3.如权利要求2所述的抗体-药物偶联物，其特征在于，LU选自下组：6-马来酰亚氨基己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧羰基(MC-val-cit-PAB)、6-马来酰亚氨基己酰基-丙氨酸-苯丙氨酸-对氨基苄氧羰基(MC-ala-phe-PAB)、马来酰亚氨基丙酰基-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧羰基(MP-val-cit-PAB)、马来酰亚氨基丙酰基-丙氨酸-苯丙氨酸-对氨基苄氧羰基(MP-ala-phe-PAB)、N-琥珀酰亚氨基4-(2-吡啶基硫基)戊酸酯(SPP)、N-琥珀酰亚氨基4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、4-(2-吡啶基二硫代)丁酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDB)或N-琥珀酰亚氨基(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)和双取代马来酰亚胺类连接子。4.如权利要求2所述的抗体-药物偶联物，其特征在于，其中D选自下组：(i)...

【专利技术属性】
技术研发人员：余科，金锐，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：上海,31