植物作为宿主在表达Antis15抗体中的应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，特别涉及植物作为宿主在表达Antis15抗体的应用。本发明专利技术利用植物例如生菜作为重组蛋白质生产的有效表达平台，利用简单以及有效的农杆菌介导真空渗透方法来表达Antis15抗体。该表达体系确定植物外源蛋白在农杆菌侵染4天后就可以收集。利用Western Blot蛋白杂交法确定Antis15抗体成功表达，用AKTA蛋白纯化系统成功纯化出Antis15单抗。活性测试结果表明Antis15在小鼠模型上一直肿瘤生长效果与PD‑1单抗持平。

Application of Plant as Host in Expressing Antis15 Antibody

【技术实现步骤摘要】
植物作为宿主在表达Antis15抗体中的应用
本专利技术涉及生物
，特别涉及植物作为宿主在表达Antis15抗体中的应用。
技术介绍
迄今为止，“谈癌色变”依旧是常态。大多数恶性肿瘤患者在确诊时已处于晚期，失去了手术机会，而肿瘤免疫逃逸的恶果始终难以遏制，导致肿瘤对许多传统疗法不敏感，预后不佳，因此，在很多人眼中“患癌”就是接到了“阎王令”。近年来，免疫疗法已经在癌症治疗上取得不小的成功，其中最有代表性的就是靶向PD-1/PD-L1通路的免疫检查点抑制剂。尽管如此，PD-1/PD-L1抗体只对少于40％的实体瘤有作用，寻找能弥补PD-1/PD-L1抗体不足的新靶点迫在眉睫。然而，晚期人类癌症的肿瘤微环境(TME)中的免疫逃避机制是高度异质的。大量证据表明，除了PD-1/PD-L1通路之外，许多其他分子或细胞机制也能导致TME中免疫功能失调。这些机制包括但不限于：免疫细胞浸润不足、调节性T细胞的积聚、肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)和髓系来源抑制细胞(MDSCs)的存在，以及抑制性分子、细胞因子、代谢物的上调。不过，有个问题是，上述的许多机制缺乏肿瘤微环境特异性，靶向这些途径可能会导致免疫系统的广泛激活，最终导致自身免疫疾病。那么，在TME中，是否有其他类似PD-1/PD-L1的分子也能调节免疫反应从而调控肿瘤的发展？陈列平教授团队发现的Siglec-15(S15)，给免疫治疗带来了新思路。S15并不简单，它的表达水平与PD-L1的表达是互斥的。简单来说，对绝大多数肿瘤而言，有PD-L1高表达就没有Siglec-15；有Siglec-15高表达就没有PD-L1。这就意味着，那些对PD-1/PD-L1抗体不响应的肿瘤，S15抗体可以完美的补足PD-1/PD-L1抗体的不足。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了植物作为宿主在表达Antis15抗体中的应用。本专利技术提供了植物作为宿主在表达Antis15抗体中的应用。本专利技术利用植物尤其是生菜作为重组蛋白生产的高效平台技术，表达了Antis15抗体。并且在温和的条件下成功分离出有活性的外源蛋白，证明植物尤其是生菜表达平台可以成功用来生产Antis15抗体蛋白。时间短(4d)，纯化简单，生产便捷。消除基因污染，消除感染人体的潜在病虫害等。大大降低生产成本，提高产品安全性。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了植物作为宿主在表达Antis15抗体中的应用；所述植物选自生菜、菠菜、番茄、萝卜、白菜、玉米、大豆、小麦或烟草；所述植物的器官选自种子、叶、根茎或整株植物。植物瞬时表达技术是在植物生长到一定阶段，利用多种不同的技术方式将含有目标蛋白的质粒转移到植物细胞中，在植物细胞中建立高效、可控的表达系统，获得该基因短暂的可控表达的技术。与稳定表达相比，瞬时表达所需时间短，不需要将外源基因整合到宿主植物染色体中，仅需几天的时间就可拿到实验结果。与细菌表达系统相比，植物表达系统可以对所表达的蛋白进行正确的折叠、加工、修饰，所生产的蛋白活性高于细菌表达系统；与动物细胞表达系统相比，植物表达系统的成本非常低，仅为其千分之一到千分之二。在上述研究的基础上，本专利技术还提供了一种表达载体，包括Antis15抗体的重链序列或轻链序列以及载体。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述Antis15抗体的重链序列或轻链序列为氨基酸序列，将Antis15抗体的重链、Antis15抗体的轻链的密码子优化为植物偏好的密码子，获得的优化Antis15抗体的重链序列或优化的Antis15抗体轻链序列。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述优化的Antis15抗体的重链的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示；所述优化的Antis15抗体的重链的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示；所述优化的Antis15抗体的轻链的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示；所述优化的Antis15抗体的轻链的氨基酸序列如SEQIDNo.4所示。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述载体为双元植物载体。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述表达载体的构建方法包括如下步骤：步骤1：分别将Antis15抗体重链、Antis15抗体轻链的密码子优化为植物偏好的密码子，获得：ⅰ.优化的Antis15抗体的重链序列；ⅱ.优化的Antis15抗体的轻链序列；步骤2：在所述优化的Antis15抗体的重链序列的5’末端分别加入Xbal限制性酶切位点，在3’末端分别加入SacI位点；在所述优化的Antis15抗体的轻链序列的5’末端加入Xbal限制性酶切位点，在3’末端加入SacI位点；克隆到pUC57载体中，分别获得pAntis15-H，pAntis15-L克隆载体；步骤3：通过Xbal/Sacl分别从步骤2所得的克隆载体中获得基因片段，克隆至双元植物载体pCam35S，分别获得表达载体p35S-Antis15-H，p35S-Antis15-L。本专利技术还提供了所述的表达载体在表达Antis15抗体中的应用。在上述研究的基础上，本专利技术提供了一种植物作为宿主表达Antis15抗体的方法，将所述的表达载体转化到农杆菌中，通过农杆菌介导真空渗透入植物组织后，提取、分离蛋白质，获得Antis15抗体。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述植物选自生菜、菠菜、番茄、萝卜、白菜、玉米、大豆、小麦或烟草；所述植物的器官选自种子、叶、根茎或整株植物。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述农杆菌介导真空渗透包括如下步骤：步骤1：抽真空25～45s；步骤2：保持真空(-95kPa)压力30～60s；步骤3：释放压力使得渗透液渗入所述植物组织；重复上述步骤2～3次，避光处理4d。本专利技术利用植物例如生菜作为重组蛋白质生产的有效表达平台，利用简单以及有效的农杆菌介导真空渗透方法来表达Antis15抗体。该表达体系确定植物外源蛋白在农杆菌侵染4天后就可以收集。利用WesternBlot蛋白杂交法确定Antis15抗体成功表达，用AKTA蛋白纯化系统成功纯化出Antis15单抗。活性测试结果表明Antis15在小鼠模型上一直肿瘤生长效果与PD-1单抗持平。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1(A)示克隆载体pAntis15-H示意图；图1(B)示pAntis15-L示意图；图2示Antis15植物双元表达载体p35S-Antis15-H(重链)以及p35S-Antis15-L(轻链)构建流程；利用限制性内切酶(Xbal/SacI)双酶切，从图1(A)、图1(B)克隆载体分别切下Antis15重链，连接入pCam35S的Xbal/SacI位点，生成植物双元表达载体p35S-Antis15-H；利用限制性内切酶(Xbal/SacI)双酶切，从图1克隆载体分别切下Antis15抗体轻链，重链，连接入pCam35S的Xbal/SacI位点，生成植物双元表达载体p35S-Antis15-L；LBandRB:Ti质粒左右边界；35S，具有烟草花叶病毒(TMV)5‘UTR的CaMV35S启动子；NPTII，用于卡那霉素抗性的编码nptII基因的表达；Nos3’，终止子；图3(A)示SDS-PAGE凝胶电泳本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.植物作为宿主在表达Antis 15抗体中的应用；所述植物选自生菜、菠菜、番茄、萝卜、白菜、玉米、大豆、小麦或烟草；所述植物的器官选自种子、叶、根茎或整株植物。

【技术特征摘要】
1.植物作为宿主在表达Antis15抗体中的应用；所述植物选自生菜、菠菜、番茄、萝卜、白菜、玉米、大豆、小麦或烟草；所述植物的器官选自种子、叶、根茎或整株植物。2.一种表达载体，其特征在于，包括Antis15抗体的重链序列或轻链序列以及载体。3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述Antis15抗体的重链序列或轻链序列为氨基酸序列，将Antis15抗体的重链、Antis15抗体的轻链的密码子优化为植物偏好的密码子，获得的优化Antis15抗体的重链序列或优化的Antis15抗体轻链序列。4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述优化的Antis15抗体的重链的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示；所述优化的Antis15抗体的重链的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示；所述优化的Antis15抗体的轻链的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示；所述优化的Antis15抗体的轻链的氨基酸序列如SEQIDNo.4所示。5.根据权利要求2至4任一项所述的表达载体，其特征在于，所述载体为双元植物载体。6.根据权利要求2至5任一项所述的表达载体，其特征在于，其构建方法包括如下步骤：步骤1：分别将Antis15抗体重链、Antis15抗体轻链的密码子优化为植物偏好的密码子，获得：ⅰ.优化的Antis15抗体的重链序列；ⅱ.优化的Antis15抗体的...

【专利技术属性】
技术研发人员：王跃驹，马磊，唐辉，
申请(专利权)人：王跃驹，
类型：发明
国别省市：美国,US