一种猪旋毛虫病抗体检测试纸条及其制备方法与应用技术

一种猪旋毛虫病抗体检测试纸条及其制备方法与应用，属于荧光免疫检测技术领域。为了更快速、稳定、准确检测旋毛虫感染，本发明专利技术提供了一种猪旋毛虫病抗体检测试纸条，包括样品垫、结合垫、层析膜、吸水垫和底板，所述结合垫上标记有时间分辨荧光微球偶联山羊抗猪IgG；所述层析膜上设有检测线与质控线，其中检测线上喷涂由原核表达的重组肌幼虫期的Ts‑WM5抗原、肠道感染性幼虫的Ts‑WN10抗原、成虫期的Ts‑ZH68抗原和新生幼虫期的Ts‑T668‑C抗原组成的旋毛虫鸡尾酒抗原；所述质控线上喷涂有兔抗山羊IgG，上述各组分组合后制备成试纸条，本发明专利技术可用于猪旋毛虫感染的早期快速检测。

A test strip for detection of swine trichinosis antibody and its preparation method and Application

【技术实现步骤摘要】
一种猪旋毛虫病抗体检测试纸条及其制备方法与应用
本专利技术属于荧光免疫检测
，具体涉及一种猪旋毛虫病抗体检测试纸条及其制备方法与应用。
技术介绍
旋毛虫病是一种危害非常严重的人兽共患病，其不但可给畜牧业生产造成巨大的经济损失，而且对人类身体健康也构成巨大威胁，人或动物主要通过生食或半生食含有旋毛虫的肉类(主要为猪肉)而发病。对于屠宰动物旋毛虫病的检验，常采用的法规检验方法为镜检法及集样消化法。然而以上两方法均存在一定的弊端，镜检法费时费力而且敏感性差，其敏感性为肉中虫体密度达到每克3条虫体时方可检出。集样消化法虽可大大提高检出率，将虫体检出率提高至每克肉1条虫体，但该方法仍十分繁琐，在发现阳性样品时仍需对阳性组采用消化法进行逐头检测。从敏感性的角度来看，由镜检法和集样消化法所造成漏检的肉类均存在安全隐患并可引起人类的感染(摄入75条虫体即可引起人的感染)。应用间接荧光免疫试验，免疫酶染色试验，免疫印迹试验，免疫吸附试验(ELISA)等技术来检测旋毛虫抗体，操作较复杂，常需要2-3个小时检测出结果，而且需要昂贵的仪器和专业技能人员在实验室完成，不能应用于现场和基层单位进行猪旋毛虫病的检测。目前，旋毛虫肌幼虫排泄分泌物ES抗原是OIE及国际旋毛虫委员会规定的唯一的用于血清学抗体检测的标准抗原。然而ES抗原成分复杂，制备繁琐、生产周期长、批次质量不均，而且存在严重的诊断盲区(感染后19d前无法检出)和交叉反应等问题，因而阻碍了其实际应用。
技术实现思路
针对如何快速、稳定、准确检测猪旋毛虫感染情况，本专利技术提供了一种猪旋毛虫病抗体检测试纸条，包括样品垫、结合垫、层析膜、吸水垫和底板，所述结合垫上标记有时间分辨荧光微球偶联山羊抗猪IgG；所述样品垫上设置有加样孔；所述层析膜上设有检测线与质控线，其中检测线上喷涂有旋毛虫鸡尾酒抗原，所述旋毛虫鸡尾酒抗原由肌幼虫期的Ts-WM5重组抗原、肠道感染性幼虫的Ts-WN10重组抗原、成虫期的Ts-ZH68重组抗原和新生幼虫期的Ts-T668-C重组抗原组成；所述质控线上喷涂有兔抗山羊IgG。进一步地限定，所述样品垫材质为玻璃纤维素膜XQ-Y8；所述结合垫材质为玻璃纤维素膜Ahistrom8964；所述层析膜材质为硝酸纤维素膜Millipore135。进一步地限定，所述旋毛虫鸡尾酒抗原中原核表达的重组肌幼虫期的Ts-WM5抗原、肠道感染性幼虫的Ts-WN10抗原、成虫期的Ts-ZH68抗原和新生幼虫期的Ts-T668-C抗原的浓度比为(0.5-1)：(0.5-1)：(0.5-0.75)：(0.5-0.75)mg/mL。本专利技术还提供了上述旋毛虫病荧光免疫层析检测试纸条的制备方法，包括如下步骤：1)旋毛虫鸡尾酒抗原的制备：分别将表达肌幼虫期的Ts-WM5重组蛋白、肠道感染性幼虫的Ts-WN10重组蛋白、成虫期的Ts-ZH68重组蛋白和新生幼虫期的Ts-T668中C端的重组蛋白的各重组质粒转化宿主菌，经诱导表达后，超声破碎菌体，离心收集沉淀，尿素溶解包涵体，然后经亲和纯化分别获得肌幼虫期的Ts-WM5重组抗原、肠道感染性幼虫的Ts-WN10重组抗原、成虫期的Ts-zh68重组抗原、新生幼虫期的Ts-T668-C重组抗原，将各重组抗原按照浓度比混合后获得旋毛虫鸡尾酒抗原；2)结合垫的制备：将时间分辨荧光微球偶联山羊抗猪IgG喷涂在结合垫上，真空抽干后干燥保存备用；3)检测线和质控线的制备：将步骤1)中获得的旋毛虫鸡尾酒抗原与0.5-1mg/mL兔抗山羊IgG分别喷涂在层析膜上，形成检测线与质控线，37℃干燥2-3h，使用封闭剂浸泡干燥后的层析膜1-2h，随后37℃干燥1-2h，密封保存备用；所述旋毛虫鸡尾酒抗原中肌幼虫期的Ts-WM5抗原、肠道感染性幼虫的Ts-WN10抗原、成虫期的Ts-ZH68抗原和新生幼虫期的Ts-T668-C抗原，终浓度分别为0.5-1mg/mL、0.5-1mg/mL、0.5-0.75mg/mL和0.5-0.75mg/mL；4)试纸条的组装：在底板上沿样品检测时的层析方向依次将样品垫、结合垫、层析垫、吸水垫粘贴在底板上，制成试纸条。进一步地限定，步骤1)所述肌幼虫期的Ts-WM5重组抗原制备时所用的引物如SEQIDNO.1-SEQIDNO.2所示；肠道感染性幼虫的Ts-WN10重组抗原制备时所用的引物如SEQIDNO.3-SEQIDNO.4所示；成虫期的Ts-ZH68重组抗原制备时所用的引物如SEQIDNO.5-SEQIDNO.6所示；新生幼虫期的Ts-T668-C重组抗原制备时所用的引物如SEQIDNO.7-SEQIDNO.8所示。进一步地限定，步骤2)所述喷涂，点样速度为50μL/cm。进一步地限定，步骤3)所述喷涂，点样速度为1μL/cm。本专利技术还提供了上述猪旋毛虫病检测试纸条在旋毛虫病检测中的应用。进一步地限定，是指将待测血清用样品稀释液稀释后，加入到试纸条加样孔中，室温静置5～10min，用紫外灯照射试纸条观察结果，待测样品如果质控线和检测线均显色，则判定为阳性；如果仅质控线显色，而检测线不显色，则判定为阴性。名词术语解释说明：肌幼虫期的Ts-WM5抗原：通过对旋毛虫肌幼虫的cDNA文库进行免疫学筛选，获得一个高丰度强反应原性的抗原蛋白，命名为WM5，生物信息学序列分析WM5蛋白属于丝氨酸蛋白抑制剂。肠道感染性幼虫的Ts-WN10抗原：通过对旋毛虫肠道感染性幼虫的cDNA文库进行免疫学筛选，获得一个高丰度强反应原性的抗原蛋白，命名为WN10，生物信息学序列分析WN10蛋白具有3个类似于cystatin的结构域，认为该蛋白属于半胱氨酸蛋白酶抑制剂样蛋白。成虫期的Ts-ZH68抗原：通过对旋毛虫3日龄成虫的cDNA文库进行免疫学筛选，获得一个高丰度强反应原性的抗原蛋白，命名为ZH68，生物信息学序列分析ZH68蛋白属于丝氨酸蛋白酶。新生幼虫期的Ts-T668-C抗原：通过对旋毛虫新生幼虫的cDNA文库进行免疫学筛选，获得一个高丰度强反应原性的抗原蛋白，命名为T668，生物信息学序列分析T668蛋白属于丝氨酸蛋白酶蛋白。肽扫描分析表明其C端是免疫显性区域，即主要的抗原区域，本专利技术使用的是其C端的免疫显性区域，记为Ts-T668-C。有益效果本专利技术利用旋毛虫不同发育时期的诊断抗原基因的原核表达重组蛋白：肌幼虫期的Ts-WM5重组蛋白、肠道感染性幼虫的Ts-WN10重组蛋白、成虫期的Ts-ZH68重组蛋白和新生幼虫期的Ts-T668重组蛋白作为猪旋毛虫病的抗体检测抗原，制备鸡尾酒抗原，所建立的旋毛虫抗体捕获荧光免疫层析检测试纸条检测方法与ESELISA相比具有高的灵敏性和特异性，显著缩短了检测盲区。本专利技术制备的试纸条具有抗原制备简单，操作简单、快速和结果易判读等ESELISA不具备的优点，同时在检测时不与其他寄生虫阳性血清发生交叉反应，特异性及灵敏度高；且具有长期稳定的特点，实用性较强、容易保存、具有市场开发价值。具有广泛推广空间，极具市场前景。附图说明图1本专利技术试纸条结构示意图；其中1为样品垫；2为底板；3为结合垫；4为硝酸纤维素膜；5为检测线；6为质控线；7为吸水垫；图2本专利技术试纸条检测结果判定示意图；其中1为加样孔；2为检测线；3为质控线；本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种猪旋毛虫病抗体检测试纸条，包括样品垫、结合垫、层析膜、吸水垫和底板，其特征在于，所述结合垫上标记有时间分辨荧光微球偶联山羊抗猪IgG；所述样品垫上设置有加样孔；所述层析膜上设有检测线与质控线，其中检测线上喷涂有旋毛虫鸡尾酒抗原，所述旋毛虫鸡尾酒抗原由肌幼虫期的Ts‑WM5重组抗原、肠道感染性幼虫的Ts‑WN10重组抗原、成虫期的Ts‑ZH68重组抗原和新生幼虫期的Ts‑T668‑C重组抗原组成；所述质控线上喷涂有兔抗山羊IgG。

【技术特征摘要】
1.一种猪旋毛虫病抗体检测试纸条，包括样品垫、结合垫、层析膜、吸水垫和底板，其特征在于，所述结合垫上标记有时间分辨荧光微球偶联山羊抗猪IgG；所述样品垫上设置有加样孔；所述层析膜上设有检测线与质控线，其中检测线上喷涂有旋毛虫鸡尾酒抗原，所述旋毛虫鸡尾酒抗原由肌幼虫期的Ts-WM5重组抗原、肠道感染性幼虫的Ts-WN10重组抗原、成虫期的Ts-ZH68重组抗原和新生幼虫期的Ts-T668-C重组抗原组成；所述质控线上喷涂有兔抗山羊IgG。2.根据权利要求1所述的猪旋毛虫病抗体检测试纸条，其特征在于，所述样品垫材质为玻璃纤维素膜XQ-Y8；所述结合垫材质为玻璃纤维素膜Ahistrom8964；所述层析膜材质为硝酸纤维素膜Millipore135。3.根据权利要求1所述的猪旋毛虫病抗体检测试纸条，其特征在于，所述旋毛虫鸡尾酒抗原中原核表达的重组肌幼虫期的Ts-WM5抗原、肠道感染性幼虫的Ts-WN10抗原、成虫期的Ts-ZH68抗原和新生幼虫期的Ts-T668-C抗原的浓度比为(0.5-1):(0.5-1)：(0.5-0.75):(0.5-0.75)mg/mL。4.权利要求1所述的猪旋毛虫病抗体检测试纸条的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：1)旋毛虫鸡尾酒抗原的制备：分别将表达肌幼虫期的Ts-WM5重组蛋白、肠道感染性幼虫的Ts-WN10重组蛋白、成虫期的Ts-ZH68重组蛋白和新生幼虫期的Ts-T668中C端的重组蛋白的各重组质粒转化宿主菌，经诱导表达后，超声破碎菌体，离心收集沉淀，尿素溶解包涵体，然后经亲和纯化分别获得肌幼虫期的Ts-WM5重组抗原、肠道感染性幼虫的Ts-WN10重组抗原、成虫期的Ts-ZH68重组抗原、新生幼虫期的Ts-T668-C重组抗原，将各重组抗原按照浓度比混合后获得旋毛虫鸡尾酒抗原；2)结合垫的制备：将时间分辨荧光微球偶联山羊抗...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘明远，刘晓雷，杨勇，王学林，白雪，唐斌，丁静，王楠，张小波，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林,22