一种检测非洲猪瘟病毒抗原荧光微球免疫试纸卡及制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种检测非洲猪瘟病毒抗原荧光微球免疫试纸卡，包括PVC底板，在PVC底板上按顺序依次固定有样品垫、荧光垫、硝酸纤维素膜、吸水垫；荧光垫内有荧光标记抗ASFV p30抗原的一个表位的单克隆抗体Mab1；硝酸纤维素膜表面划有检测线和质控线，检测线为针对ASFV p30抗原另一表位的单克隆抗体Mab2，质控线为羊抗小鼠IgG抗体。适用于发病猪外周血、血清、唾液、组织(肺脏、脾脏)研磨液内ASFV p30抗原的检测，在短时间内诊断出ASFV感染，特别适合现场ASFV感染诊断、流行病学调查和生猪国际贸易检疫检验；与免疫荧光分析仪协同使用直接显示结果，操作迅速简单、准确率高，具有很强的实用性。

A fluorescent microsphere immunoassay card for detection of African swine fever virus antigen and its preparation method and Application

【技术实现步骤摘要】
一种检测非洲猪瘟病毒抗原荧光微球免疫试纸卡及制备方法和应用
本专利技术涉及一种检测非洲猪瘟病毒抗原荧光微球免疫试纸卡，具体涉及一种检测非洲猪瘟病毒抗原荧光微球免疫试纸卡及制备方法和应用，属于病毒疫病诊断技术和动物检疫

技术介绍
非洲猪瘟(ASF)是猪的一种高度接触性传染病，高致病性的ASFV感染家猪后死亡率可达100％，该病一直在许多非洲国家流行，目前已传播到格鲁齐亚、亚美尼亚、阿塞拜疆和俄罗斯等邻国，2018年8月该病进入我国，给我国养猪业造成巨大损失。由于目前无疫苗用于ASF防疫，因此快速、准确的诊断对防止该病的传播、流行十分重要。世界动物卫生组织(OIE)推荐的ASF抗原诊断技术包括病原检测、核酸鉴定和病毒抗原检测。在病原检测常用的技术中，血吸附试验是经典的ASF诊断方法之一，敏感性较高，但需要临时制备和培养猪骨髓细胞，不仅费时、操作繁琐，而且不能用于非血吸附性毒株的诊断；检测ASFV抗原的荧光抗体试验可用于可疑病猪组织和白细胞样品的检测，不仅适用于非血吸附性毒株的鉴定，而且能与其它病毒感染进行鉴别诊断，但需要制备冰冻切片或涂片，技术难度较大，而且只能在专门的ASF诊断参考实验室进行。ASFV核酸鉴定常用的方法为聚合酶链式反应(PCR)和实时定量PCR，这些方法具有快速、灵敏等优点，还适合腐败样品的病毒检测，已成为主要的ASF诊断技术，但需要较昂贵的仪器设备和防污染措施，有时检测结果需用序列测定等方法验证。ASFV抗原检测也是常用的ASF诊断方法，常用的有免疫荧光法、免疫印迹试验、胶体金检测试纸等。免疫荧光法、免疫印迹试验需要专业人员使用专业的仪器设备进行操作，一般基层实验室、养殖场、农户等无法开展；胶体金试纸检测ASFV抗原具有方便、快捷优点，但检测灵敏度有待进一步提高。
技术实现思路
为解决现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种操作迅速简单、准确率高的用于检测非洲猪瘟病毒抗原荧光微球免疫试纸卡。为了实现上述目标，本专利技术采用如下的技术方案：一种检测非洲猪瘟病毒抗原荧光微球免疫试纸卡，其特征在于，包括PVC底板，在PVC底板上按顺序依次固定有样品垫、荧光垫、硝酸纤维素膜、吸水垫；其中，荧光垫内有荧光标记抗ASFVp30抗原的一个表位的单克隆抗体Mab1；硝酸纤维素膜表面划有检测线和质控线，检测线为针对ASFVp30抗原另一表位的单克隆抗体Mab2，质控线为羊抗小鼠IgG抗体。上述抗ASFVp30单克隆抗体Mab1和Mab2针对的抗原表位均位于p30aa145-aa154，且体Mab1和Mab2具体针对的表位不同。上述的分泌单克隆抗体Mab1的杂交瘤细胞保藏于武汉大学保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为：CCTCCNO:C2018158，分类命名为：杂交瘤细胞株6G12，保藏日期为：2018.9.5；分泌单克隆抗体Mab2的杂交瘤细胞保藏于武汉大学保藏中心，地址中国.武汉.武汉大学，保藏编号为：CCTCCNO:C2018159，分类命名为：杂交瘤细胞株3H6，保藏日期为：2018.9.5。上述的检测线的Mab2工作浓度为1.0mg/mL，质控线的羊抗鼠IgG抗体工作浓度为1.0mg/ml，Mab2抗体和羊抗鼠IgG抗体划膜时喷涂量均为1μL/cm，且检测线与质控线之间距离为5mm。上述的荧光标记抗ASFVp30抗原的单克隆抗体Mab1，包括以下步骤：S1、将未处理的荧光垫浸泡于处理液中，取出后，恒温干燥，制得预处理的荧光垫；S2、将铕荧光微球加入EDC溶液中，振荡活化荧光微球；S3、于纯化单克隆抗体Mab1中，加入标记液缓冲液，混合均匀后，加入活化的荧光微球，恒温振荡；S4、平衡PDMiniTrapG-25脱盐柱后，制得标记的荧光微球溶液；S5、将标记的荧光微球溶液喷至预处理的荧光垫上，恒温干燥。上述步骤S1中的处理液包括：0.02MPBS缓冲液，pH7.2、3％蔗糖、0.1％PEG20000、0.5％BSA、0.5％Tween-20；浸泡时间为30min，干燥温度为37℃；所述步骤S2中的铕荧光微球为1mg200nm；EDC溶液为100μL40mg/ml，振荡时间为1min；所述步骤S3中的纯化单克隆抗体Mab1为1mg，标记液缓冲液为1MMES，pH5.0，10μl；加入活化的荧光微球为12μL，恒温振荡时间为1h；所述步骤S5中标记的荧光微球溶液的喷量为5μL/cm，干燥温度为37℃。上述的一种检测非洲猪瘟病毒抗原荧光微球免疫试纸卡的制备方法，包括以下步骤：A1、将PVC底板粘面朝上，将硝酸纤维素膜粘在PVC板中间位置，A2、将荧光垫粘附于硝酸纤维素膜前；A3、在荧光垫前、硝酸纤维素膜后分别将样品垫、吸水垫粘附在PVC底板上，制得试纸条；A4、将试纸条置于带加样孔的外壳内，组装成试纸卡；所述加样孔正对样品垫。进一步的，上述样品垫与荧光垫、荧光垫与硝酸纤维素膜、硝酸纤维素膜与吸水垫部分叠合，且叠合宽度为2mm；试纸条的宽度为3.5mm。使用时，将1滴待检样品滴加于试纸卡的加样孔，加入3滴样品稀释液，室温静置后，插入便携免疫荧光分析仪，通过收集及分析免疫荧光分析仪检测到的荧光信号，转换成检测值；若检测值＞29.49，则结果判定为阳性，表明样品中存在ASFV抗原；若检测值≤29.49，则结果判定为阴性，表明样品中无ASFV抗原。进一步的，上述样品稀释液包括0.8％氯化钠，0.05％BSA，0.5％Tween-20；室温静置时间为10min。本专利技术的有益之处在于：本专利技术的一种检测非洲猪瘟病毒抗原荧光微球免疫试纸卡，适用于发病猪全血、血清、唾液、组织(肺脏、脾脏)研磨液内ASFVp30抗原的检测，可在短时间内诊断出ASFV感染，特别适合现场ASFV感染诊断、流行病学调查和生猪国际贸易检疫检验。其与便携免疫荧光分析仪协同使用，可直接显示检测结果，使用方便、操作迅速简单、准确率高，避免人为因素干扰，具有很强的实用性；且，本专利技术不限于用本检测方法检测的ASFVp30抗原，亦包括其它的可用于检测的ASFV抗原；抗体亦可相应换成针对非洲猪瘟病毒其他蛋白的单克隆抗体或多克隆抗体，具有广泛的适用性。附图说明图1为本专利技术的荧光微球免疫试纸卡的组装结构示意图。附图中标记的含义如下：1、上壳体，2、下壳体，3、加样孔，4、可视窗，5、样品垫，6、荧光垫，7、硝酸纤维素膜，8、吸水垫，9、检测线，10、质控线。具体实施方式以下结合附图和具体实施例对本专利技术作具体的介绍。生物材料来源：扬州大学制备的分泌单克隆抗体Mab1的杂交瘤细胞保藏于武汉大学保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为：CCTCCNO:C2018158，分类命名为：杂交瘤细胞株6G12，保藏日期为：2018.9.5；分泌单克隆抗体Mab2的杂交瘤细胞保藏于武汉大学保藏中心，地址中国.武汉.武汉大学，保藏编号为：CCTCCNO:C2018159，分类命名为：杂交瘤细胞株3H6，保藏日期为：2018.9.5。大肠杆菌中表达、纯化的非洲猪瘟病毒p30重组蛋白：由扬州大学制备；直径200nm铕荧光微球：购于美国BangsLaboratories.Inc；牛血清白蛋白(BSA)、羊抗小鼠IgG抗体：购于美国Sigma公司。如图1所示本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测非洲猪瘟病毒抗原荧光微球免疫试纸卡，其特征在于，包括PVC底板，在PVC底板上按顺序依次固定有样品垫、荧光垫、硝酸纤维素膜、吸水垫；荧光垫内有荧光标记抗ASFV p30抗原的一个表位的单克隆抗体Mab1；硝酸纤维素膜表面划有检测线和质控线，检测线为针对ASFV p30抗原另一表位的单克隆抗体Mab2，质控线为羊抗小鼠IgG抗体。

【技术特征摘要】
1.一种检测非洲猪瘟病毒抗原荧光微球免疫试纸卡，其特征在于，包括PVC底板，在PVC底板上按顺序依次固定有样品垫、荧光垫、硝酸纤维素膜、吸水垫；荧光垫内有荧光标记抗ASFVp30抗原的一个表位的单克隆抗体Mab1；硝酸纤维素膜表面划有检测线和质控线，检测线为针对ASFVp30抗原另一表位的单克隆抗体Mab2，质控线为羊抗小鼠IgG抗体。2.根据权利要求1所述的一种检测非洲猪瘟病毒抗原荧光微球免疫试纸卡，其特征在于，所述抗ASFVp30单克隆抗体Mab1和Mab2针对的抗原表位均位于p30aa145-aa154，且体Mab1和Mab2具体针对的表位不同。3.根据权利要求1所述的一种检测非洲猪瘟病毒抗原荧光微球免疫试纸卡，其特征在于，分泌单克隆抗体Mab1的杂交瘤细胞保藏于武汉大学保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为：CCTCCNO:C2018158，分类命名为：杂交瘤细胞株6G12，保藏日期为：2018.9.5；分泌单克隆抗体Mab2的杂交瘤细胞保藏于武汉大学保藏中心，地址中国.武汉.武汉大学，保藏编号为：CCTCCNO:C2018159，分类命名为：杂交瘤细胞株3H6，保藏日期为：2018.9.5。4.根据权利要求1所述的一种检测非洲猪瘟病毒抗原荧光微球免疫试纸卡，其特征在于，检测线的Mab2工作浓度为1.0mg/mL，质控线的羊抗鼠IgG抗体工作浓度为1.0mg/ml，Mab2抗体和羊抗鼠IgG抗体划膜时喷涂量均为1μL/cm，且检测线与质控线之间距离为5mm。5.根据权利要求1所述的一种检测非洲猪瘟病毒抗原荧光微球免疫试纸卡的制备方法，其特征在于，荧光标记抗ASFVp30抗原的单克隆抗体Mab1，包括以下步骤：S1、将未处理的荧光垫浸泡于处理液中，取出后，恒温干燥，制得预处理的荧光垫；S2、将铕荧光微球加入EDC溶液中，振荡活化荧光微球；S3、于纯化单克隆抗体Mab1中，加入标记液缓冲液，混合均匀后，加入活化的荧光微球，恒温振荡；S4、平衡PDMiniTrapG-25脱盐柱后，制得标记的荧光微球溶液；S5、将标记的荧光微球...

【专利技术属性】
技术研发人员：张鑫宇，刘潇羽，党红军，熊新灿，孙怀昌，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32