一种禽滑液囊支原体间接ELISA检测试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了一种禽滑液囊支原体间接ELISA检测试剂盒，所述试剂盒以一株禽滑液囊支原体宁夏分离株经重叠PCR扩增出的主要膜抗原MSPB重组蛋白为包被抗原。本发明专利技术的试剂盒能够快速、特异、有效地检测禽滑液囊支原体，以监测鸡群中滑液囊支原体病的流行情况。

A Kit for Indirect ELISA Detection of Mycoplasma in Avian Synovial Saccharomyces

【技术实现步骤摘要】
一种禽滑液囊支原体间接ELISA检测试剂盒
本专利技术属于动物疫病病原快速诊断领域，尤其是一种禽滑液囊支原体快速血清学诊断方法。
技术介绍
禽滑液囊支原体（（Mycoplasmasynoviae，MS）是感染禽类和鸟类的一种重要的病原微生物，1954年Olson和Wills在美国于鸡体内首次发现。禽滑液囊支原体是一种能够导致禽类和鸟类发生多种疾病，且感染率极高的重要病原微生物，可以导致禽、鸟类发生关节炎、滑液囊炎和腱鞘炎、呼吸道和气囊感染等多种疾病，临床上多见禽滑液囊支原体与各种病毒、细菌、寄生虫的混合感染。1980年9月李跃庭在我国广西梧州的一批70-85日龄表现跛行、关节肿大症状的雏鸡中首次分离得到禽滑液囊支原体，初次证实了该病在我国的存在。随着养殖业的扩大和贸易往来日益频繁，禽滑液囊支原体在我国的传播速度越来越快，流行范围也越来越广。宿主一旦感染禽滑液囊支原体便终生带毒，不能根除，所以控制此病最好的措施就是做好预防。作为疫病综合防控的重要环节，快速、特异的诊断技术是必不可少的。要做好禽滑液囊支原体病的防控，需要用高效的检测方法对其流行病学进行调查。ELISA作为进行禽滑液囊支原体流行病学调查的重要检测方法，以其快速、便捷的优点被广泛用于禽滑液囊支原体的检测与诊断，但是已存在的ELISA试剂盒在检测禽滑液囊支原体时会出现一定的假阳性，并且我国尚无针对禽滑液囊支原体的商品化ELISA试剂盒。因此，为了尽早控制该病在我国的流行，本领域亟需快速、高效、准确的滑液囊支原体血清学诊断方法，进而开展滑液囊支原体感染的诊断、治疗与防控研究。禽滑液囊支原体的感染宿主范围较广，在各种禽类和鸟类中普遍存在，自年1954年以来相继在已经在鸡、鹅、鸽、鸭、火鸡及其它鸟类等多种动物中分离到禽滑液囊支原体，而从不同宿主中分离到的禽滑液囊支原体在致病性、基因序列和一些主要蛋白的编码都存在差异。
技术实现思路
本专利技术在国内首次建立间接ELISA方法对禽滑液囊支原体进行抗体检测。能够对禽滑液囊支原体抗体进行快速有效地检测，是一种快速、简便的间接ELILSA检测方法。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的第一方面：MSPB蛋白的制备方法，以禽滑液囊支原体宁夏分离株NX-7的基因组作为模板，利用设计合成的四对特异性引物进行重叠PCR扩增，回收扩增的PCR产物；所述引物对包括：MSPB-F15'GCCGGATCCATGAAAAATAA3'MSPB-R15'GATTCATCTGTCCATTGGAATG3'MSPB-F25'CATTCCAATGGACAGATGAATC3'MSPB-R25'ATTTTTCTCTAGCTTTGGTCCAAG3'MSPB-F35'CTTGGACCAAAGCTAGAGAAAAAT3'MSPB-R35'ATAAACCCGTCCCAGTATAGTGT3'MSPB-F45'ACACTATACTGGGACGGGTTTAT3'MSPB-R45'CTTCTCGAGTTAATCTTCGTGAGT3'将扩增的PCR产物、pET-30a表达载体先用BamHI与XhoI酶切后再连接，构建重组表达质粒；将重组表达质粒转化BL21(DE3)感受态细胞，并采用异丙基硫代半乳糖苷诱导表达，将获得的表达产物进行纯化，即得所述MSPB蛋白。作为优选，所述禽滑液囊支原体MSPB蛋白重组抗原的包被量为1μg/ml/孔。进一步的，所述间接ELISA检测试剂盒还包含酶标抗体、样品稀释液、洗涤液、阴性对照血清、阳性对照血清、底物显色液和终止液。作为优选，所述试剂盒还包括封闭液，所述封闭液为1%脱脂奶粉。作为优选，所述试剂盒还包括包被缓冲液，所述包被缓冲液为0.01MpH9.6的碳酸盐缓冲液。作为优选，所述试剂盒还包括血清稀释液，所述血清稀释液为1%脱脂奶粉。作为优选，所述试剂盒酶标抗体为辣根过氧化物酶标羊抗鸡抗体。上述间接ELISA检测试剂盒在禽滑液囊支原体的流行病学调查中的应用也是本专利技术的保护范围；所述禽滑液囊支原体为宁夏分离株NX-7。本专利技术的第二方面，提供一种禽滑液囊支原体抗体的间接ELISA检测方法，包括以下步骤：（1）包被以宁夏本地株NX-7MSPB重组蛋白作为包被抗原，将抗原稀释后加入到96孔板中，37℃孵育1h后4℃过夜孵育，采用PBST进行洗涤。（2）封闭：采用PBST稀释的1%脱脂奶粉100μL/孔进行封闭，37℃条件下孵育60min后甩干，用PBST洗涤；（3）血清作用条件：每孔加入待检血清稀释液，37℃条件下孵育60min后甩干，用PBST洗涤；（4）二抗孵育条件：将酶标羊抗鸡IgG用按1:3000稀释，每孔加100μL/孔，37℃条件下作用60min后甩干，用PBST洗涤；（5）底物显色：底物显色液100μL/孔，37℃条件下避光作用20min；（6）终止反应：每孔加终止液50μL终止显色反应采用酶标仪吸光度450nm下读取数据；（7）阴阳性临界值的确定：根据公式阴阳性临界值=阴性样本OD450平均值标准偏差3SD，得到阴阳性临界值；当在OD450在0.324以上，判定为阳性。步骤（1）中，所述禽滑液囊支原体MSPB重组蛋白由如下方法制备而成：以禽滑液囊支原体宁夏分离株NX-7的全基因组作为模板，利用设计合成的特异性引物对MSPB基因进行重叠PCR扩增，回收扩增的PCR产物，将扩增的PCR产物、pET-30a表达载体先用BamHI与XhoI酶切后再连接，构建重组表达质粒；将重组表达质粒转化BL21(DE3)感受态细胞，并采用异丙基硫代半乳糖苷诱导表达，将获得的表达产物进行纯化，即得所述MSPB蛋白,所述引物对包括：MSPB-F15'GCCGGATCCATGAAAAATAA3'MSPB-R15'GATTCATCTGTCCATTGGAATG3'MSPB-F25'CATTCCAATGGACAGATGAATC3'MSPB-R25'ATTTTTCTCTAGCTTTGGTCCAAG3'MSPB-F35'CTTGGACCAAAGCTAGAGAAAAAT3'MSPB-R35'ATAAACCCGTCCCAGTATAGTGT3'MSPB-F45'ACACTATACTGGGACGGGTTTAT3'MSPB-R45'CTTCTCGAGTTAATCTTCGTGAGT3'.较之现有技术而言，本专利技术的优点在于：目前国内尚未有针对禽滑液囊支原体间接ELISA检测方法的研究报道。本专利技术利用原核表达的禽滑液囊支原体MSPB蛋白作为包被抗原，建立了检测禽滑液囊支原体病血清抗体的间接ELISA方法。1、本专利技术以MSPB蛋白作为包被抗原建立间接ELISA检测方法，可以快速检测禽滑液囊支原体抗体，具有良好的特异性。对临床样品进行检测，结果表明本方法可以作为禽滑液囊支原体抗体检测的一种方法而运用到生产实际中。2、本专利技术的检测方法还具有检测快速、便捷的优点。附图说明图1是MSPB蛋白纯化的SDS-PAGE分析。图2是MSPB蛋白的Westernblotting分析。具体实施方式下面实施例对本
技术实现思路
进行详细说明：MSPB蛋白的制备方法，以禽滑液囊支原体宁夏分离株NX-7的核酸作为模板，利用设计合成的特异性引物进行重叠PCR扩增，回收扩增的PCR产物。所述产物序列如本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种蛋白的制备：以禽滑液囊支原体宁夏分离株 NX‑7的全基因组作为模板，利用设计合成的特异性引物进行重叠PCR扩增，回收扩增的PCR产物，将扩增的PCR产物、pET‑30a表达载体先用

【技术特征摘要】
1.一种蛋白的制备：以禽滑液囊支原体宁夏分离株NX-7的全基因组作为模板，利用设计合成的特异性引物进行重叠PCR扩增，回收扩增的PCR产物，将扩增的PCR产物、pET-30a表达载体先用BamHI与XhoI酶切后再连接，构建重组表达质粒；将重组表达质粒转化BL21(DE3)感受态细胞，并采用异丙基硫代半乳糖苷诱导表达，将获得的表达产物进行纯化，即得所述禽滑液囊支原体主要膜抗原MSPB蛋白,所述引物对包括：MSPB-F15'GCCGGATCCATGAAAAATAA3'MSPB-R15'GATTCATCTGTCCATTGGAATG3'MSPB-F25'CATTCCAATGGACAGATGAATC3'MSPB-R25'ATTTTTCTCTAGCTTTGGTCCAAG3'MSPB-F35'CTTGGACCAAAGCTAGAGAAAAAT3'MSPB-R35'ATAAACCCGTCCCAGTATAGTGT3'MSPB-F45'ACACTATACTGGGACGGGTTTAT3'MSPB-R45'CTTCTCGAGTTAATCTTCGTGAGT3'所述MSPB蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。2.一种禽滑液囊支原体间接ELISA检测方法的建立，其特征如下：以MSPB蛋白作为包被抗原包被酶标板，将待测血清样品经稀释后加入酶标板孵育，加入酶标二抗孵育后显色，测定反应后血清样品的OD值。3.根据权利要求2所述的禽滑液囊支原体间接ELISA检测方法，其特征在于：具体包括以下步骤：(1)包被：以MSPB蛋白为包被抗原，将其稀释后，加入96孔的ELISA孔板上，每孔100μL，37℃孵育1h4℃过夜；每孔加入300μL的洗涤液洗涤3次，洗完后将板拍干；(2)封闭：每孔加入100μL封闭剂，37℃，封闭1h；弃去孔中多余的封...

【专利技术属性】
技术研发人员：李继东，何生虎，司朵朵，郭亚男，魏晓明，郭磊，
申请(专利权)人：宁夏大学，宁夏晓鸣农牧股份有限公司，
类型：发明
国别省市：宁夏,64