猪塞尼卡谷病毒ELISA抗体检测方法及应用技术

本发明专利技术提供一种猪塞尼卡谷病毒ELISA抗体检测方法及应用，该方法以SVV 3AB重组蛋白作为包被抗原，本发明专利技术的3AB ELISA抗体检测方法作为一种检测工具，可用于临床血清检测，为疫病的诊断、SVV抗体检测试剂盒的研发奠定了基础。

Detection and application of ELISA antibody to swine Seneca virus

【技术实现步骤摘要】
猪塞尼卡谷病毒ELISA抗体检测方法及应用
本专利技术属于免疫学检测方法领域，具体涉及猪塞尼卡谷病毒ELISA抗体检测方法及应用。
技术介绍
塞尼卡谷病毒(Senecavirus，SVV)属于小RNA病毒科、塞尼卡谷病毒属，与心脏病毒属成员非常相似，是一种无囊膜、单股正链RNA病毒。近年来，美国、巴西、泰国、澳大利亚、意大利、加拿大和中国报道了SVV感染，表明SVV已迅速进化与传播。感染猪群引发水疱病和流行性短暂新生儿损失(ETNL)。该病临床症状类似口蹄疫(FMD)、猪水疱病(SVD)、水疱性口炎(VS)和水疱疹(VE)等水疱性动物疾病，危害养猪业健康发展。SVV具有其他小RNA病毒典型的基因组特征，遵循标准的L-4-3-4布局。其基因组长度约7280个核苷酸，包括5’UTR(666bp)、单个长开放阅读框(6543bp)和3’UTR(71bp)。单个长开放阅读框(ORF)可以编码2181个氨基酸多蛋白，在病毒蛋白酶的作用下被切割成12个成熟蛋白，顺序为：L-VP4-VP2-VP3-VP1-2A-2B-2C-3A-3B-3C-3D。其中，VP1、VP2、VP3能在病毒衣壳外表面表达，已被证明可与炭疽毒素受体1共同相互作用以引发感染并进一步诱导宿主细胞抗体应答；3A被认为是小RNA病毒复制复合体和膜结构结合的锚定蛋白且与病毒诱导的细胞病理效应和阻断细胞内蛋白的分解有关；3B被称为病毒基因组连接蛋白(VPg)，可与新生小RNA病毒5’端共价相连，可能具有RNA合成引物的作用。常用的SVV感染检测方法主要包括：病毒中和试验(VNT)、间接免疫荧光试验(IFA)、反转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、酶联吸附免疫测定(ELISA)及病毒分离和鉴定。目前，国外学者已经建立SVVVP1ELISA抗体检测方法，用于测定猪群是否受SVV感染，但其特异性和敏感性尚不理想，而且我国也没有商品化检测试剂盒。本研究比较了感染仔猪几种病毒编码蛋白(VP1、2C、3A、3AB、3C、3D、L)的抗体产生动态，发现SVV3AB的抗原性较好。鉴此，我们建立了3AB间接ELISA抗体检测方法，并用于SVV血清流行病学调查。
技术实现思路
针对
技术介绍
提出的技术问题，本专利技术的目的在于提供一种猪塞尼卡谷病毒ELISA抗体检测方法及应用。本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：一种猪塞尼卡谷病毒ELISA抗体检测试剂盒，该试剂盒以SVV3AB重组蛋白作为包被抗原。所述SVV3AB重组蛋白的制备方法为：设计特异性引物：SVV-3AB-F：5'GAGGAATTCAGCCCTAACGA3'SVV-3AB-R：5'GCGCTCGAGTCACTGTTGCATTTC3'，将SVV3AB基因片段克隆至pET30a(+)表达载体获得重组质粒，将重组质粒转化至感受态的表达菌E.coliBL21(DE3)中进行诱导表达，收集上清液进行纯化，得到纯化后的重组蛋白。作为一种优选技术方案，该试剂盒还包括封闭液、包被缓冲液、血清稀释液和酶标二抗，进一步还包括TMB显色液和终止液。进一步优选的，所述的封闭液为5％(g/100ml)脱脂乳，所述的包被缓冲液为pH9.6的碳酸盐缓冲液(称取0.17g无水Na2CO3、0.28gNaHCO3于双蒸水中并定容至100ml)，所述的血清稀释液为PBST，所述的酶标二抗为HRP-SPA。上述的试剂盒在检测猪塞尼卡谷病毒中的应用，所述应用不以疾病的诊断和治疗为目的。一种非诊疗目的的猪塞尼卡谷病毒间接ELISA抗体检测方法，该方法步骤如下：(1)包被酶标板：将纯化后的权利要求1或2中所述的SVV3AB重组蛋白包被微孔板；包被浓度为1.0μg/mL；包被条件为37℃放置2h后，4℃放置12h；(2)封闭酶标板；以5％脱脂乳37℃封闭3h；(3)加入稀释后的待检血清，37℃孵育45min；所述稀释为用血清稀释液将待检血清作100倍稀释；(4)加入以1:10000稀释的酶标二抗HRP-SPA，37℃作用30min；(5)显色，终止，并在酶标仪上读取OD450值。优选为，加入显色液显色15min。SVV3AB重组蛋白作为包被抗原在制备猪塞尼卡谷病毒ELISA抗体检测试剂盒中的应用。本专利技术的有益效果：塞尼卡谷病毒(SVV)是危害我国养猪业的一种新的病原，其临床症状与口蹄疫等水疱性动物疾病难以区分，目前我国尚无抗体检测试剂盒。本研究采用大肠杆菌表达系统制备获得SVV3AB、2C、3C、3D、L和VP1重组蛋白，测定SVV感染猪血清中上述病毒蛋白抗体产生规律，发现SVV3AB蛋白抗体产生时间最快、抗体水平较高且持续时间较长。通过反应条件优化，建立了3AB-ELISA抗体检测方法，其敏感性为91.3％，特异性为92.59％，与PRRSV、CSFV、PRV、PCV2和O型FMDV抗体无交叉性，变异系数均小于15％。该方法与病毒中和抗体试验符合率为92.0％。采用该方法测定2014-2018年临床健康猪群血清3249份，抗体阳性率为84.0％，为我国该防控提供了重要方法和流行病学数据。总之，3ABELISA抗体检测方法作为一种检测工具，可用于临床血清检测，为疫病的诊断、SVV抗体检测试剂盒的研发奠定了基础。附图说明图1为SVV重组蛋白的鉴定其中，M，蛋白质分子质量标准；1，pET-32a(m)空载对照；2，VP1重组蛋白；3，pET-28a空载对照；4，L重组蛋白；5，2C重组蛋白；6，3AB重组蛋白；7，3C重组蛋白；8，3D重组蛋白图2为SVV感染仔猪不同病毒编码蛋白抗体产生动态分析图3为ELISA反应条件的优化图4为华东地区SVV感染的回顾性分析。具体实施方式1材料和方法1.1病毒、血清、质粒及试剂SVVSD毒株、中和抗体阳性猪血清、中和抗体阴性血清及攻毒血清由本实验室保存。临床猪血清样品3249份，来自山东、江苏省的126个猪场。pET-28a(+)、pET-32a(m)E.coliBL21(DE3)由本实验室保存。实验过程所涉及的SVVSD毒株为本领域技术人员公知的常规毒株，载体为可以通过市场购买的常规载体。HRP标记的金黄色葡萄球菌A蛋白(HRP-SPA)抗体购自博士德生物技术有限公司，TMB显色液购自上海碧云天生物技术有限公司，限制性内切酶、T4连接酶购自TaKaRa生物科技有限公司，超灵敏ECL化学发光试剂盒为Pierce公司产品，质粒提取试剂盒购自Biomiga生物科技有限公司，其他试剂均为国产分析纯。1.2引物合成根据SVVSD毒株(GenBank：MH779611)序列，利用Primer5.0人工合成VP1、2C、3AB、3C、3D、L六个基因片段的特异性引物，见表1。表1引物合成病毒感染细胞后，提取RNA经反转录获得cDNA，以此为模板扩增获得2C、3AB、3C、3D、L基因片段。将2C、3AB、3C、3D、L基因克隆至pET-28a(+)，VP1基因克隆至pET-32a(m)载体，获得的重组质粒委托金斯瑞生物技术有限公司进行测序。1.3重组蛋白的诱导表达及纯化将测序准确的重组质粒转化至表达菌E.coliBL21(DE3)，挑取单菌落于3mlLB培养过夜，留作菌种；进行小量诱导并进行表本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种猪塞尼卡谷病毒ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒以SVV 3AB重组蛋白作为包被抗原。

【技术特征摘要】
1.一种猪塞尼卡谷病毒ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒以SVV3AB重组蛋白作为包被抗原。2.根据权利要求1所述的猪塞尼卡谷病毒ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述SVV3AB重组蛋白的制备方法为：设计特异性引物：SVV-3AB-F：5'GAGGAATTCAGCCCTAACGA3'SVV-3AB-R：5'GCGCTCGAGTCACTGTTGCATTTC3'，将SVV3AB基因片段克隆至pET30a(+)表达载体获得重组质粒，将重组质粒转化至感受态的表达菌E.coliBL21(DE3)中进行诱导表达，收集上清液进行纯化，得到纯化后的重组蛋白。3.根据权利要求1所述的猪塞尼卡谷病毒ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括封闭液、包被缓冲液、血清稀释液和酶标二抗。4.根据权利要求3所述的猪塞尼卡谷病毒ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述的封闭液为5％脱脂乳，所述的包被缓冲液为pH9.6的碳酸盐缓冲液，所述的血清稀释液为PBST，所述的酶标二抗为HRP-SPA。5.权利要求1-4中任一项所述的试剂盒在检测猪塞尼卡谷病毒中的应用，所述应用不以疾病的诊断和治疗为目的。6.一种非诊...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜平，延君芳，范慧，白娟，李亮，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32