沙门菌fimW基因新型可视化LAMP快速检测引物组与试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种靶向沙门菌fimW基因的新型可视化LAMP快速检测引物组与试剂盒。本发明专利技术通过优化反应条件，发明专利技术了一种靶向沙门菌fimW基因的新型可视化LAMP快速检测引物组与试剂盒，并对其特异性和敏感性进行了测试，意料之外地发现其具有很强的特异性，最低可检出菌液浓度为7.3×10

Rapid detection of Salmonella fimW gene with new visualized LAMP primers and kits

【技术实现步骤摘要】
沙门菌fimW基因新型可视化LAMP快速检测引物组与试剂盒
本专利技术属于微生物检测领域，具体地说，涉及一种靶向沙门菌fimW基因的新型可视化LAMP快速检测引物组与试剂盒。
技术介绍
沙门菌(salmonella)作为临床常见的食源性人兽共患病原菌，是一种无荚膜的革兰氏阴性直杆菌。目前沙门菌已报道至少2500个血清型，国内报道有300多种，不同血清型沙门氏菌的侵袭力与致病力显著不同，其所引起的疾病都是和宿主相互对应的。感染沙门菌可见发热、败血、恶心、食欲不振、下痢等症状。除了能够通过污染食物引起人类食物中毒感染外，沙门菌感染在畜禽生产中也很常见，在猪生产中造成仔猪副伤寒、在家禽生产中可引发鸡白痢、鸡伤寒，鸡副伤寒等疾病，往往对生产生活造成很大损失。沙门菌菌毛类型众多，主要有Ⅰ型～Ⅳ型等，Ⅰ型菌毛蛋白由fimA、fimI、fimC、fimD、fimH、fimF、fimZ、fimY和fimW9个基因编码，其中主要菌毛亚单位蛋白fimA的调控基因主要有fimZ、fimY和fimW。众多菌毛类型中只有Ⅰ型菌毛广泛分布在各血清型的沙门菌中，其他型菌毛分布的血清型均有限。将fimW序列在Gen-Bank上进行比对，结果显示含有fimW基因的都为沙门菌，而且在其它肠道杆菌的基因组中未发现与fimW同源的序列，说明fimW基因是沙门菌特有的基因。目前，对沙门氏菌的检测主要是以传统的细菌分离和生化鉴定等方法为主，存在操作繁琐、灵敏度低和准确率不高等缺陷，不能满足及时有效的质量监测和疾病控制需求。随着分子生物学技术的发展，新的诊断技术如酶联免疫、免疫荧光、PCR、荧光定量PCR等检测病原核酸和蛋白质等生物大分子的方法已经广泛应用到沙门氏菌的检测中。然而，这些技术在应用过程中或需要熟练的操作人员，或需要昂贵的仪器设备，不适合在出入境口岸或兽医基层进行广泛的推广应用。环介导等温扩增(LAMP)技术作为一种新颖的恒温核酸扩增方法，具有操作简便、高特异性、高敏感性等特点。其原理是针对靶基因的多个区域设计多种特异引物，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶(BstDNAploymerase)，在恒温条件(60℃-65℃)下作用几十分钟，即可完成核酸扩增反应。由于其对仪器设备要求低，一台水浴锅或恒温箱就能实现反应，结果通过肉眼观察即可判断，简便快捷，适合基层快速诊断，近年来已被广泛应用于病原体检测。目前LAMP的结果判别方法包括电泳、添加SYBRGreenⅠ荧光染料或金属离子指示剂进行可视化判别，如钙黄绿素(黄绿色-橙红色)、羟基萘酚蓝(蓝紫色-天蓝色)等。然而，这些试剂或需开盖添加、或色差变化较小不易分辨。研究表明，当DNA聚合酶将一个脱氧核苷酸分子结合到新的DNA双链上时，会产生一个氢离子作为副产物，氢离子浓度的增加造成反应体系PH值的降低，基于此，本专利技术采用了甲酚红作为PH指示剂用于结果的判定，反应结果色差易分辨(黄色为阳性，红色为阴性)，无需开盖。其特异性强，敏感性比常规PCR方法高1000倍。临床检测表明，该试剂盒符合率高，取预增菌的菌液可直接作为模板进行检测，不会发生漏检。如中国专利CN201711409788.1公开了一种快速检测猪圆环病毒3型的LAMP引物组、试剂盒及应用。该引物组包含核苷酸序列如SEQIDNO.1～6所示的引物组；试剂盒包括上述的引物组、反应试剂；该试剂盒的使用方法如下：首先配制扩增反应体系；恒温反应所得产物直接进行肉眼判读：阳性结果为黄色，阴性结果为红色，该试剂盒操作简单、成本低廉，结果易于观察，非常适用于出口检疫、食品卫生以及畜牧养殖场的现场检测，但该专利技术仅针对猪圆环病毒3型。本专利技术根据沙门菌fimW基因，专利技术了沙门菌新型可视化LAMP快速检测引物组和试剂盒，用以沙门氏菌的检测。
技术实现思路
为解决以上问题，本专利技术的目的在于提供一种靶向沙门菌fimW基因的新型可视化LAMP快速检测引物组与试剂盒。首先，本专利技术提供一种靶向沙门菌fimW基因的LAMP引物组。本专利技术按照沙门菌fimW基因，设计了LAMP引物组，如表1所示，同时根据沙门菌国家检测标准，标准号为GB/T28642-2012，合成沙门菌PCR国标检测引物，如表2所示；表1表2本专利技术还提供一种靶向沙门菌fimW基因的试剂盒，包括上述的靶向沙门菌fimW基因的LAMP引物组。本专利技术公开了一种用上述引物组或试剂盒在检测待测样品是否感染沙门菌的应用。本专利技术还公开了一种检测待测样品是否感染沙门菌的方法，包括如下步骤：(3)用引物组或试剂盒对待测样品进行LAMP扩增，得到扩增产物；(2)结果判断：肉眼即可判断；阴性：若扩增产物呈现红色，证明待测样品没有感染沙门菌；阳性：若扩增产物呈现黄色，证明待测样品感染了沙门菌；进一步的，步骤(1)LAMP扩增反应体系为25μl，其中LAMPMix12.5μL、FIP、BIP引物(10μmol/L)3μL，F3、B3引物(10μlmol/L)0.5μL，LF引物(10μlmol/L)1μL，模板2.5μL，其余用超纯水补齐；进一步的，LAMPMix包括(NH4)2SO4、KCl、Tween-20、甲酚红溶液、KOH、dNTP、甜菜碱、MgSO4和Bst酶；优选地，外引物、内引物和环引物的比例为1:6:2；优选地，步骤(1)LAMP反应体系，反应温度62℃，反应时间40min。本专利技术有益效果(1)本专利技术首次针对沙门菌fimW基因建立沙门菌的LAMP方法；(2)本专利技术的检测敏感性极高，是常规PCR检测的1000倍，明显高于现有技术；(3)本专利技术简化了检验流程，预增菌的菌液可直接作为模板进行检测，不发生漏检。(4)指示剂通过甲酚红显色，实验结果实现可视化观察，不用开盖，非常适合在出入境口岸或兽医基层进行广泛的推广应用。附图说明图1为实施例2的最佳反应温度筛选结果图；图2为实验例1LAMP特异性试验结果图；图3为实验例2PCR特异性试验结果图；图4为实验例3PCR检测方法敏感性结果图；图5为实验例3LAMP敏感性试验结果图；图6为实验例4临床样本LAMP检测结果图。具体实施方式为了使本领域人员更好地理解本专利技术方案，下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步的详细说明。本专利技术的鼠伤寒标准菌ATCC14028购自美国菌株保藏中心(ATCC)、沙门菌菌株、铜绿假单胞菌株、鸭疫里默氏杆菌菌株、空肠弯曲菌菌株、结肠弯曲菌菌株由华南农业大学实验室鉴定保存。本专利技术的LB肉汤、LB琼脂、XLT4琼脂基础、缓冲蛋白胨水溶液(BPW)和四硫磺酸盐煌绿增菌液基础(TTB)均购自广东环凯微生物科技有限公司；磷酸盐缓冲剂(PBS)购自鼎国昌盛生物技术有限公司；细菌基因组DNA快速抽提试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。实施例1细菌基因组DNA的提取取4株不同血清型沙门菌，即鸡白痢沙门菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌和鸡伤寒沙门菌；5株非沙门菌，即空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、铜绿假单胞菌(2株)和鸭疫里默氏杆菌在营养琼脂或血琼脂平板上划线接种，按各自所需条件培养到相应时间，筛选取单菌落接种到营养肉汤后，在摇床振摇培养，然后培养物用水煮裂解法或按细菌基因组DNA快速抽提试剂盒的说明进行，制得各菌株DNA模板。实施例2沙门菌LAMP检测方法的建立按梯本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种靶向沙门菌fimW基因的LAMP引物组，其特征在于，由外引物F3、B3，内引物FIP、BIP和环引物IF组成；外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；环引物LF的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

【技术特征摘要】
1.一种靶向沙门菌fimW基因的LAMP引物组，其特征在于，由外引物F3、B3，内引物FIP、BIP和环引物IF组成；外引物F3的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；外引物B3的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；内引物FIP的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；内引物BIP的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；环引物LF的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。2.一种检测沙门菌的LAMP试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的靶向沙门菌fimW基因的LAMP引物组。3.如权利要求2所述的LAMP试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括LAMPMix12.5μL和DNA模板2.5μL；其中，LAMPMix包括(NH4)2SO4、KCl、Tween-20、甲酚红溶液、KOH、dNTP、甜菜碱、MgSO4和Bst酶。4.如权利要求1所述的引物组或权利要求2所述的试剂盒在检测沙门菌中的应用。5.一种检测待测样品是否感染沙门菌的方法，包括如下步骤：(1)用引物组或试剂盒对待测样品进...

【专利技术属性】
技术研发人员：张建民，温俊平，勾红潮，廖明，王少君，瞿孝云，詹泽强，高远，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44