单核细胞增生李斯特菌血清型4h多重PCR检测试剂盒制造技术

本发明专利技术提供一种单核细胞增生李斯特菌血清型4h多重PCR检测试剂盒，所述试剂盒中包括基因lmo1210检测引物以及基因xysn_1693检测引物。本发明专利技术建立了利用两对引物快速检测单核细胞增生李斯特菌血清型4h的多重PCR方法，具有特异性好，灵敏度高，检测速度快，易于操作和结果判定的优点，适用于多种来源样品的检测。

Detection Kit of Listeria monocytogenes Serotype by 4h Multiplex PCR

【技术实现步骤摘要】
单核细胞增生李斯特菌血清型4h多重PCR检测试剂盒
本专利技术涉及一种生物检测试剂盒，特别是涉及一种单核细胞增生李斯特菌血清型4h的多重PCR检测试剂盒。
技术介绍
单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes,LM)是一种重要的食源性人兽共患病原菌，其对食品安全及人类健康的危害已经引起很多国家的高度重视。单核细胞增生李斯特菌引起的人和动物的李斯特菌病具有低发病率、高致死率的特点。据统计，人李斯特菌病发病率约每百万人0.1～11.3例，死亡率为20％～30％。单核细胞增生李斯特菌包括4个进化谱系，14种血清型。其中1/2a、1/2b和4b是引起李斯特菌病的主要血清型，而4h是我国发现的一种新的李斯特菌血清型。血清型4h的单核细胞增生李斯特菌通常具有超强毒力，李斯特菌病的爆发多与超强毒力菌株的出现有关，因此，建立单核细胞增生李斯特菌尤其是针对血清型4h的快速、有效的检测方法对于李斯特菌的监测与控制是非常必要的。目前食品中单核细胞增生李斯特菌的检测方法通常参照食品安全国家标准GB4789.30-2016，在样品增菌培养及选择性培养后进行传统的生化鉴定实验。该方法能够较为准确地检出单核细胞增生李斯特菌，但同时也存在着耗时耗力，且不能快速区分超强毒力单核细胞增生李斯特菌的不足。因此，提供一种新的快速便捷的检测方法十分必要。
技术实现思路
鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种单核细胞增生李斯特菌血清型4h的多重PCR检测试剂盒，用于解决现有技术中无法直接检测单核细胞增生李斯特菌血清型4h的问题，该方法操作简单，准确度高，耗时短，满足现在食品安全检测的需要。为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术的第一方面提供了基因lmo1210以及基因xysn_1693在制备检测单核细胞增生李斯特菌血清型4h检测试剂盒中的用途。将基因lmo1210以及基因xysn_1693用于制备单核细胞增生李斯特菌血清型4h检测试剂，是指将基因lmo1210以及基因xysn_1693作为检测靶标应用于单核细胞增生李斯特菌血清型4h的检测。本专利技术的一些实施方式中，基于所述基因lmo1210以及基因xysn_1693的序列，筛选特异性针对基因lmo1210以及基因xysn_1693扩增引物对从而作为增生李斯特菌血清型4h检测试剂。上述用途应当是基因lmo1210以及基因xysn_1693共同作用的结果，并非是单个基因分别发挥作用。本专利技术提供一种单核细胞增生李斯特菌血清型4h的多重PCR检测试剂盒，所述试剂盒中包括基因lmo1210检测引物以及基因xysn_1693检测引物。优选地，所述基因lmo1210检测引物包括核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的正向引物和核苷酸序列如SEQIDNO.4所示的反向引物。进一步地，基因lmo1210检测引物扩增区域核苷酸序列如SEQIDNO：5所示。检测片段长度为211bp。优选地，所述基因xysn_1693检测引物包括核苷酸序列如SEQIDNO.6所示的正向引物和核苷酸序列如SEQIDNO.7所示的反向引物。进一步地，基因xysn_1693检测引物扩增区域核苷酸序列如SEQIDNO：8所示。检测片段长度为429bp。本专利技术采用PCR技术对基因lmo1210以及基因xysn_1693进行检测，根据其扩增情况可判断检测对象是否属于单核细胞增生李斯特菌血清型4h。因此，引物的设计是本专利技术的试剂盒的关键。基于本专利技术所述试剂盒是采用PCR技术来进行检测的，所以试剂盒中还可以包括其他一些PCR所需要的常规试剂，如：ddH2O、dNTP、PCRbuffer、rTaq酶、样品基因组DNA提取试剂等常用PCR反应试剂中的一种或多种。由于此类PCR常用试剂均可经市场途径单独购得或者自行配置，因此具体需要将哪些试剂装配入试剂盒，可以根据客户实际需要配置，为方便起见，也可全部装配入试剂盒。本专利技术的试剂盒，可以是含有独立包装的引物对，也可以是含有配置好的含有引物对的PCR检测液。所述PCR检测液可自行配置，也可直接以市售的不含引物的通用PCR反应液加入引物获得。例如，所述试剂盒中还可以含有ddH2O、dNTP、PCRbuffer、rTaq酶。加入本专利技术的引物、待检样本DNA提取物或者样本菌液即可获得PCR反应体系。优选地，所述试剂盒中还可含有阳性对照。所述阳性对照为含有基因lmo1210和/或基因xysn_1693表达的DNA样本。优选地，所述试剂盒中还可含有阴性对照。阴性对照可为无基因lmo1210和基因xysn_1693表达的DNA样本。本专利技术的第二方面提供了上述多重PCR检测试剂盒的检测方法，所述方法包括以下步骤：(1)提取样品基因组DNA；(2)加样：将样品基因组DNA、阳性对照和/或阴性对照分别加入装有PCR反应体系的PCR管中，获得对应的样品反应管、阳性反应管和/或阴性反应管，所述PCR反应体系中含有前述基因lmo1210以及基因xysn_1693检测引物；(3)PCR反应：反应管置于PCR仪上，设置循环参数，进行PCR反应；(4)PCR反应结束后，分析结果。上述方法为非疾病诊断目的方法。进一步地，所述步骤(1)中，提取样品基因组DNA为现有技术，本领域技术人员可以根据现有操作方法制备。进一步地，所述步骤(3)中PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s，35个循环；72℃终止10min。进一步地，所述步骤(4)中结果分析判定方法如下：同时扩增出211bp和429bp条带时，判定为血清型4h的单核细胞增生李斯特菌阳性；仅扩增出211bp条带时，判定为其他血清型单核细胞增生李斯特菌阳性；无条带则为单核细胞增生李斯特菌阴性。本专利技术的第三方面提供了上述试剂盒在制备基因lmo1210以及基因xysn_1693检测产品中的用途。所述检测产品用于检测单核细胞增生李斯特菌血清型4h。如上所述，本专利技术的单核细胞增生李斯特菌血清型4h的多重PCR检测试剂盒，具有以下有益效果：本专利技术利用了PCR扩增技术，建立了利用两对引物快速检测单核细胞增生李斯特菌血清型4h的多重PCR方法，该方法具有特异性好，灵敏度高，检测速度快，易与操作和判定结果的优点。经李斯特菌属和非李斯特菌属菌株的实际样本检测，未出现假阳性结果，具有良好的特异性。附图说明图1a和1b为本专利技术实施例1中的多重PCR方法特异性评价实验结果。其中M.DL2000；CK.阴性对照；1-2.单核细胞增生李斯特菌血清型4h菌株；3-14.依次为血清型1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4ab、4b、4c、4d和7的单核细胞增生李斯特菌；15.伊氏李斯特菌；16.无害李斯特菌；17.塞氏李斯特菌；18.格氏李斯特菌；19.威氏李斯特菌；20.肠炎沙门菌；21.鸡白痢沙门菌；22.鼠伤寒沙门菌，23.副溶血弧菌；24.大肠杆菌；25.金黄色葡萄球菌；26.空肠弯曲菌；27.结肠弯曲菌。图2为本专利技术实施例1中的多重PCR方法灵敏度评价的实验结果。其中M.DL2000；CK.阴性对照；1-9.单核细胞增生李斯特菌血清型4h菌株XYSN基因组DNA浓度分别为100ng/μL、10ng/μL、1ng/本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基因lmo1210以及基因xysn_1693在制备单核细胞增生李斯特菌血清型4h多重PCR检测试剂盒中的用途。

【技术特征摘要】
1.基因lmo1210以及基因xysn_1693在制备单核细胞增生李斯特菌血清型4h多重PCR检测试剂盒中的用途。2.一种单核细胞增生李斯特菌血清型4h多重PCR检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中包括基因lmo1210检测引物以及基因xysn_1693检测引物。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述基因lmo1210检测引物包括核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的正向引物和核苷酸序列如SEQIDNO.4所示的反向引物。4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述基因xysn_1693检测引物包括核苷酸序列如SEQIDNO.6所示的正向引物和核苷酸序列如SEQIDNO.7所示的反向引物。5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包含ddH2O、dNTP、PCRbuffer、rTaq酶、样品基因组DNA提取试剂中的一种或多种。6.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有阳性对照和/或阴性对照。7.如权利要求2～6任意一项所述的试剂盒的检测方法，所述方法包括以下步骤：(1)提取样品基因组DN...

【专利技术属性】
技术研发人员：焦新安，殷月兰，冯有为，姚浩，孙昕宇，潘志明，陈祥，王晶，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32