针对人鼠共患病病原微生物的PCR引物对、试剂盒及其用途制造技术

本发明专利技术公开了一种针对人鼠共患病病原微生物的PCR引物对，分别用于扩增问号钩端螺旋体、莫氏立克次体、恙虫病东方体、嗜吞噬细胞无形体、土拉弗朗西斯菌、贝氏柯科斯体和巴尔通体的特异性基因。使用该PCR引物对，根据TSP原理建立起了高敏感性和特异性地单独或组合检测如上七种病原体的方法。

Primer pairs, kits and applications of PCR for pathogenic microorganisms of human-rat co-morbidity

【技术实现步骤摘要】
针对人鼠共患病病原微生物的PCR引物对、试剂盒及其用途
本专利技术属于微生物学领域，特别涉及七种鼠传病病原微生物的多重PCR检测方法及其试剂与应用。
技术介绍
鼠传疾病是指由鼠类引起的、在人与人/动物之间传播的人兽共患传染病，也称人鼠共患病。鼠类能将某些病毒、细菌、立克次体、原虫和蠕虫等病原体传播给人类和家畜，是多种人畜共患病病原体的储存宿主。近年来，随着全球化进程加快，人类活动增强，人和物的流动性增强，鼠传疾病流行区域也不断扩大，多种新发鼠传疾病出现还有部分老传染病复燃[1-3]，如问号钩端螺旋体(Leptospirainterrogans，Lep)引起的钩体病和莫氏立克次体(Rickettsiaetyphi，Rt)引起的地方性斑疹伤寒是我国法定传染病，多年来一直困扰我国人民的身体健康，由恙虫病东方体(Orientiatsutsugamushi，Ot)、嗜吞噬细胞无形体(Anaplasmaphagocytophilum，Ap)、土拉弗朗西斯菌(Francisellatularensis，Ft)、贝氏柯科斯体(Coxiellaburnetii，Cb)和巴尔通体(Bartonella，Bar)引起的传染病是近年来新发和重复复燃的传染病，传播速度快，散播面积广，危害性大，其中Cb引发的疫区遍布全球，成为分布最广的人兽共患病之一[4]，所引起的疫情造成巨大的卫生经济负担，使得鼠传疾病的防控工作面临挑战。及时准确地检测病原体是预防控制鼠传疾病的关键步骤之一，为进一步制定防控策略和持续监测提供基础。传统检测方法如分离培养、血清学检测法等操作通量小、灵敏度较低，以核酸分子检测技术为基础的各种高通量检测方法应运而生，如蔡婧等[5]用多重实时荧光探针法实现对3种致病型伯氏疏螺旋体分型检测，通过设计1对通用引物和3条特异探针完成检测，最低检测极限可达5copies/μl，但该方法因检测通道数有限限制了被检病原种类数；Jana等[6]建立了一种将DNA微阵列与PCR技术结合检测蜱传病原体的方法，基于16S可变区同时检测贝氏柯科斯体、立克次体和土拉弗朗西斯菌，检测极限分别是10copies/μl，100copies/μl，1copies/μl，该方法操作复杂且费用昂贵。参考文献[1]余向华,张孝和,倪庆翔,等.鼠传疾病流行病学研究进展[J].中国媒介生物学及控制杂志,2015,26(06):634-636.[2]BordesF,BlasdellK,MorandS.Transmissionecologyofrodent-bornediseases:Newfrontiers[J].IntegrZool,2015,10(5):424-435.[3]LiuQ,XuW,LuS,etal.Landscapeofemergingandre-emerginginfectiousdiseasesinChina:impactofecology,climate,andbehavior[J].FrontMed,2018,12(1):3-22.[4]贾广乐,王晓楠,廖娟红,等.Q热贝纳柯克斯体SYBRGreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立[J].中国畜牧兽医,2013,40(7):18-21.[5]蔡婧.伯氏疏螺旋体分型多重实时荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用[D].河北:承德医学院病原生物学,2015.[6]J,DerdákováM,BarákI.Asystemtosimultaneouslydetecttick-bornepathogensbasedonthevariabilityofthe16Sribosomalgenes[J].Parasites&Vectors,2013,6(1):269.[7]恙虫病预防控制技术指南[S].中疾控疾发〔2009〕1号.2009.[8]史永林,王誓闻,胡万富,张永根,刘红,曹明华,张丽娟.安徽地区家畜嗜吞噬细胞无形体16SrRNA基因检测和序列分析.安徽预防医学杂志,2013,19(5):329-330,338.[9]FulopM,LeslieD,TitballR.Arapid,highlysensitivemethodforthedetectionofFrancisellatularensisinclinicalsamplesusingthepolymerasechainreaction.TheAmericanjournaloftropicalmedicineandhygiene,1996,54(4):364.[10]徐建国.现场细菌学.科学出版社,2011.[11]BrennerDJ,O'ConnorSP,WinklerHH,SteigerwaltAG.ProposalstounifythegeneraBartonellaandRochalimaea,withdescriptionsofBartonellaquintanacomb.nov.,Bartonellavinsoniicomb.nov.,Bartonellahenselaecomb.nov.,andBartonellaelizabethaecomb.nov.,andtoremovethefamilyBartonellaceaefromtheorderRickettsiales.IntJSystBacteriol,1993,43(4):777-786.[12]亚红祥,赫兢,张丽娟,白丽.贝氏柯克斯体实时荧光定量PCR方法的建立及对云南鼠标本检测.传染病信息,2009,22(06):345-347.[13]张晶波,温博海,陈梅玲,朱丽娜,邱玲,牛东升.荧光定量PCR检测嗜吞噬细胞无形体.中国人兽共患病学报,2006(04):289-293.[14]史清海,曲识,周冬生,郭兆彪,翟俊辉,杨瑞馥.应用TaqMan荧光定量PCR检测土拉弗朗西斯菌.生物技术通讯,2009(06):806-809.[15]杨晓,陈梅玲,温博海,牛东升,孙长俭,李青凤.实时荧光定量PCR检测莫氏立克次体.解放军医学杂志,2007(10):1054-1056.[16]张翠彩,李秀文,聂一新,杨会棉,蒋秀高.致病性钩端螺旋体TaqManReal-timePCR检测技术的建立及其应用.中华流行病学杂志,2011,32(10):1018-1021.[17]付秀萍,贺金荣,张景山,王景泉.TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR检测恙虫病东方体方法的建立.中国媒介生物学及控制杂志,2012,23(2):108-110.[18]DiazMH,BaiY,MalaniaL,WinchellJM,KosoyMY.Developmentofanovelgenus-specificreal-timePCRassayfordetectionanddifferentiationofBartonellaspeciesandgenotypes.JClinMicrobiol,2012,50(5):1645-1649.
技术实现思路
本专利技术运用微生物数据分析云平台筛选基因设计引物，建立一种高效、快速、简便的多重鼠传病原菌检测方法，为一系列鼠传疾病病原的检测、监测、食品卫生监查、流行病学本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种针对人鼠共患病病原微生物的PCR引物对，所述PCR引物对选自针对恙虫病东方体的引物对、针对莫氏立克次体的引物对、针对嗜吞噬细胞无形体的引物对、针对土拉弗朗西斯菌的引物对、针对贝氏柯科斯体的引物对、针对问号钩端螺旋体的引物对和针对巴尔通体的引物对中的任一对、任两对、任三对、任四对、任五对、任六对或共七对。

【技术特征摘要】
1.一种针对人鼠共患病病原微生物的PCR引物对，所述PCR引物对选自针对恙虫病东方体的引物对、针对莫氏立克次体的引物对、针对嗜吞噬细胞无形体的引物对、针对土拉弗朗西斯菌的引物对、针对贝氏柯科斯体的引物对、针对问号钩端螺旋体的引物对和针对巴尔通体的引物对中的任一对、任两对、任三对、任四对、任五对、任六对或共七对。2.如权利要求1所述的PCR引物对，其特征在于：所述针对恙虫病东方体的引物对是针对GenBank号为AM494475.1的基因的引物对；所述针对莫氏立克次体的引物对是针对GenBank号为AE017197.1的基因的引物对；所述针对嗜吞噬细胞无形体的引物对是针对GenBank号为CP000235.1的基因的引物对；所述针对土拉弗朗西斯菌的引物对是针对GenBank号为AJ749949.2的基因的引物对；所述针对贝氏柯科斯体的引物对是针对GenBank号为AE016828.3的基因的引物对；所述针对问号钩端螺旋体的引物对是针对GenBank号为AE010300.2的基因的引物对；所述针对巴尔通体的引物对是针对GenBank号为BX897699.1的基因的引物对。3.如权利要求1或2所述的PCR引物对，其特征在于：所述针对恙虫病东方体的引物对是针对GenBank号为AM494475.1的基因组碱基序列中第1350022位-第1350510位所在基因或其同源基因的引物对；所述针对莫氏立克次体的引物对是针对GenBank号为AE017197.1的基因组碱基序列中第280273位-第282033位所在基因或其同源基因的引物对；所述针对嗜吞噬细胞无形体的引物对是针对GenBank号为CP000235.1的基因组碱基序列中第80911位-第82092位所在基因或其同源基因的引物对；所述针对土拉弗朗西斯菌的引物对是针对GenBank号为AJ749949.2的基因组碱基序列中第1196328位-第1196651位所在基因或其同源基因的引物对；所述针对贝氏柯科斯体的引物对是针对GenBank号为AE016828.3的基因组碱基序列中第1935473位-第1936219位所在基因或其同源基因的引物对；所述针对问号钩端螺旋体的引物对是针对GenBank号为AE010300.2的基因组碱基序列中第99185位-第100006位所在基因或其同源基因的引物对；所述针对巴尔通体的引物对是针对GenBank号为BX897699.1的基因组碱基序列中第103924位-第104511位所在基因或其同源基因的引物对。4.如权利要求3所述的PCR引物对，其特征在于：所述针对恙虫病东方体的引物对的特异性碱基序列分别如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示；所述针对莫氏立克次体的引物对的特异性碱基序列分别如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示；所述针对嗜吞噬细胞无形体的引物对的特异性碱基序列分别如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示；所述针对土拉弗朗西斯菌的引物对的特异性碱基序列分别如SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示；所述针对贝氏柯科斯体的引物对是针对的特异性碱基序列分别如SEQIDNO.9和SEQIDNO.10所示；所述针对问号钩端螺旋体的引物对的特异性碱基序列分别如SEQIDNO.11...

【专利技术属性】
技术研发人员：栗冬梅，刘起勇，张燕君，宋秀平，康央，
申请(专利权)人：中国疾病预防控制中心传染病预防控制所，
类型：发明
国别省市：北京,11