用于检测田间软腐果胶杆菌胡萝卜亚种的引物组及其DNA提取检测试剂盒和方法技术

本发明专利技术公开了一种用于检测田间软腐果胶杆菌胡萝卜亚种的引物组及其快速检测试剂盒和方法；该试剂盒基于软腐病原菌特异性靶点单碱基差异现象，将样品核酸快速提取技术与环介导等温扩增技术相结合建立的细菌性软腐病原菌产品。该检测方法对软腐病原菌、植物组织、土壤样品均可进行快速检测，核酸提取在30s内即可完成，检测用时仅需30min‑40min，检测快速、准确，无需任何昂贵仪器、成本低，可直接用于田间实时实地检测，利于土壤中软腐病原菌的动态监测，利于开展软腐病的流行预测及早期预警工作，利于进行病害早期防治。

Primers and DNA extraction kits and methods for detection of Carrot subspecies of Soft-rotting Pectin Bacillus in field

【技术实现步骤摘要】
用于检测田间软腐果胶杆菌胡萝卜亚种的引物组及其DNA提取检测试剂盒和方法
本专利技术涉及核酸提取、基因检测诊断领域，具体涉及一种用于检测田间软腐果胶杆菌胡萝卜亚种的引物组及其快速检测试剂盒和方法。
技术介绍
现阶段，随着保护地的发展、高附加值作物的连年栽培以及秸秆还田、免耕技术的推广等，土壤中病原菌大量积累，从而引起土传病害的发生。土传病害具有种类繁多，分布范围广，传播快，危害大，治理难等特点。病原菌可在土壤中越冬，来年继续侵害作物，如此循环，导致病害更加严重。一般情况下，土传病害危害植物的根茎，在作物生长前期，可导致幼苗根茎腐烂、死亡；在作物生长后期，可使作物严重减产，危害严重。通常情况下，作物栽种3-5年后，产量和品质均受到严重影响，可减产20％-40％，严重情况减产60％以上甚至绝收。建立快速、准确、操作简便的土传病原菌检测方法，实地进行土传病害预测预报，为土传病害实时监测提供技术支持成为当前土传病害防治的重要内容之一。常见的土传细菌性病害包括软腐病，青枯病等。细菌性软腐病是蔬菜上一类重要病害，该病害主要是由欧文氏菌属细菌引起的，主要为害十字花科作物、番茄、马铃薯、瓜类等植物，可使植物的组织或器官腐烂。除在植物的生长期外，在运输和贮藏期均容易发生病害。田间病害调查发现，随着大白菜栽培面积的不断扩大及种植年限不断增加，软腐病等土传病害有加重发展的趋势，严重影响了大白菜的生产，且病害一旦发生，蔓延迅速，防治难度极大。大白菜软腐病是大白菜的主要病害之一，与霜霉病和病毒病统称为大白菜的三大病害。软腐病的发病范围广、周期长，处于生长期、储藏期和货架期的大白菜均可受害。适宜环境条件下，该病害可使大白菜减产50％以上，甚至造成个别地块绝产。2017年10月，河南省虞城县杜集镇发生大面积的大白菜软腐病病害，损失极大。KazuhisaTsuda等学者指出引起该病害的主要病原菌为Pectobacteriumcarotovorumsubsp.carotovorum。2017年北京市农林科学院李晓颖等在北京房山区大白菜软腐发病样本中分离得到Pectobacteriumaroidearum。在此之前，由P.aroidearum引发的软腐病害在国内尚未被报道。迄今为止，软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacteriumcarotovorumsubsp.carotovorum)仍是十字花科作物细菌性软腐病害的主要致病菌。由于软腐病原菌可以在土壤中越冬，极难被杀死；且该病原菌寄主范围广泛，除为害大白菜外，其他十字花科作物、番茄、马铃薯、芹菜等均可受害。可见，病害一旦发生，治理难度大，对多种植物均存在威胁。土传病害防治过程中，土壤中病原菌的快速鉴定和检测可为病害的预测预报和早期防治提供参考。目前，病原微生物检测通常采用形态学、生理生化等传统病原菌检测方法以及分子技术手段。传统检测方法原理简单、操作简便、成本低廉，但该类检测方法用时长，耗费精力大，且不能对植物组织、土壤直接检测。常用的分子检测方法包括PCR、qPCR、高通量检测等，这类检测方法需要昂贵的仪器设备，成本高且环境要求高，无法实现田间实地检测。环介导等温核酸扩增技术(LAMP)是2000年由日本学者Notomi等专利技术的一种恒温核酸扩增技术，该技术主要利用一套可识别靶基因六个特定区域的特异性引物，在BstDNA聚合酶的作用下，60℃-65℃恒温环境中发生自循环链置换反应，60分钟内即可完成反应，无需任何昂贵仪器设备且应用范围广。结果可通过琼脂糖凝胶电泳检测有无梯状条带、浊度检测判断，或者通过向反应体系中添加金属离子络合剂、金属离子指示剂等方法判断，通过其结合不同金属离子而呈现不同颜色的这一特性来判断反应情况。例如，羟基萘酚蓝(HNB)是一种金属离子指示剂，当溶液中存在Mg2+时，颜色为紫红色，随着反应的进行，大量生成的焦磷酸根离子与Mg2+结合，形成一种白色的焦磷酸镁沉淀副产物，消耗了溶液中的Mg2+，颜色会由紫红色变为天蓝色。目前，公开号为CN109207475A的中国专利技术专利申请公开了一种快速核酸提取方法，可在1分钟内完成核酸的提取，并将产物用于PCR、RPA法扩增。该方法快速、简便，但是专利申请中样本量少，缺少实地实时应用；核酸提取用时1分钟，与本专利申请中核酸提取用时30s相比，该方法用时更长，且在PCR、RPA核酸扩增方面无具体方法描述。公开号为CN105018631A的中国专利技术专利申请公开了一种基于环介导等温扩增技术检测胡萝卜软腐果胶杆菌的方法。专利中以软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacteriumcarotovorumsubsp.carotovorum)的pmrA基因设计引物，可特异性检测Pectobacteriumcarotovorum。通过向反应管中添加钙黄绿素后，反应管有无荧光进行结果判断。专利中公开其特异性引物由以下组成：正向内引物FIP：5'-CCTGAGAGCCGGCTTTCAGCTGCTGACGCCGAAAGAGT-3'，反向内引物BIP：5'-CCTGGAACGATGACCCGTCTTCCTTGTGACGCAGATTGTGGA-3'；正向外引物F3：5'-GCTGGATGACAAGCCAGTG-3'，反向外引物B3：5'-CGGATGCGGTCTTTCCCTA-3'；环引物Loop：5'-ACCAGGCGGGACAGTATCG-3'该方法只能特异性检测胡萝卜软腐果胶杆菌，并不能区分其亚种，但是实际病害调查及大量文献报道表明，软腐果胶杆菌不同亚种对不同植物的危害存在显著差异。而且，该方法仅对植物发病组织总DNA以及细菌悬液进行检测，但是对于土传病害的防治工作，实地实时对土壤含菌情况进行检测，更有助于病害预防工作的开展，专利中并未将所述方法用于田间实地检测。更重要的是，该方法在样本处理时，需使用细菌DNA提取试剂盒、离心柱型植物基因组DNA提取试剂盒，分别提取病原菌和植物组织的DNA用于LAMP检测，提取过程用时长且试剂盒的成本高，不利于在田间实地应用。公开号为CN107447049A的中国专利技术专利申请公开了一种土壤中快速检测病原微生物的方法，基于环介导等温扩增技术，对镰刀菌、腐霉菌等土传病原微生物建立了检测方法。然而，专利申请中所述的检测方法，需要使用商品化试剂盒提取核酸，且未对申请中的引物进行灵敏性检测，在引物特异性检测中仅涉及了5种目标病原微生物及3组对照样本，样品量不足，其灵敏度和特异性存在争议。为了更有利于解决当前土传病害防治难的实际问题，特异性强、灵敏度高、成本低、环境条件要求低的土传病原菌快速检测方法在土传病害预测预报过程中是不可或缺的技术手段。目前，尚缺乏可应用于田间的土传病原菌核酸快速提取、检测一体化方法的设想和验证。
技术实现思路
本专利技术的第一目的是针对目前缺乏可特异性检测软腐果胶杆菌胡萝卜亚种的方法这一现状，提供了一种用于检测田间软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacteriumcarotovorumsubsp.carotovorum)的引物组。本专利技术的第二目的是针对现有缺乏田间土传病原菌核酸快速提取、检测一体化方法的现状，提供了一种软腐病原菌快速检测试剂盒，该试剂盒为田间病害实地监测提供技术支持，其以软腐病本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测软腐果胶杆菌胡萝卜亚种的引物组，其特征在于：所述引物组为特异性检测的引物组，其为：正向外引物Pcc‑F3：5'‑GGCCAAAGAAGCAGACGC‑3'，反向外引物Pcc‑B3：5'‑GGCTTGGCAAGGTAATCGT‑3'；正向内引物Pcc‑FIP：5'‑GCCCATCTTCATCCGGTAAGCCCATCAGCAGCGCGCATTA‑3'，反向内引物Pcc‑BIP：5'‑ATCATTACCAGCATCCCGTGCTCGCTGACGCGATCGTTTA‑3'。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测软腐果胶杆菌胡萝卜亚种的引物组，其特征在于：所述引物组为特异性检测的引物组，其为：正向外引物Pcc-F3：5'-GGCCAAAGAAGCAGACGC-3'，反向外引物Pcc-B3：5'-GGCTTGGCAAGGTAATCGT-3'；正向内引物Pcc-FIP：5'-GCCCATCTTCATCCGGTAAGCCCATCAGCAGCGCGCATTA-3'，反向内引物Pcc-BIP：5'-ATCATTACCAGCATCCCGTGCTCGCTGACGCGATCGTTTA-3'。2.一种权利要求1所示引物组在检查田间软腐果胶杆菌胡萝卜亚种中的应用。3.一种检测田间软腐果胶杆菌胡萝卜亚种的试剂盒，所述试剂盒包括核酸快速提取盒和检测盒，其特征在于：所述核酸快速提取盒包括裂解液、研磨球、核酸提取盘、洗涤液、洗脱液；所述检测盒包括权利要求1所述引物组、检测反应液；其中，所述引物组为：正向外引物Pcc-F3：5'-GGCCAAAGAAGCAGACGC-3'，反向外引物Pcc-B3：5'-GGCTTGGCAAGGTAATCGT-3'；正向内引物Pcc-FIP：5'-GCCCATCTTCATCCGGTAAGCCCATCAGCAGCGCGCATTA-3'，反向内引物Pcc-BIP：5'-ATCATTACCAGCATCCCGTGCTCGCTGACGCGATCGTTTA-3'。4.根据权利要求1所述检测田间软腐果胶杆菌胡萝卜亚种的试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒由引物组和检测反应液组成；所述检测反应液包括：10x等温扩增反应缓冲液、100mMMgSO4，10mMdNTPMix，5M甜菜碱，8U/μLBst2.0DNA聚合酶和羟基萘...

【专利技术属性】
技术研发人员：游红，陈若琳，李建洪，万虎，何顺，朱福兴，马洪菊，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42