一种检测呼吸道病原体核酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种检测呼吸道病原体核酸的方法。本发明专利技术研究得到基于CRISPR/Cas12a技术检测3种呼吸道病原的特异性核酸序列位点，针对该位点利用CRISPR/Cas12a系统可实现这3种病原的定性检测，能特异性区分这3种病原的不同型别；并构建了基于CRISPR/Cas12a的呼吸道病原核酸检测检测系统和检测试剂盒。该技术对呼吸道病原核酸检测特异性好、灵敏度高，还能够实现多位点同时检测，同时该技术可在室温下进行，操作方便快捷，检测成本低，对于呼吸道病原的检测与筛查具有重要的意义，应用前景好。

A Method for Detecting Nucleic Acids of Respiratory Pathogens

【技术实现步骤摘要】
一种检测呼吸道病原体核酸的方法
本专利技术属于分子生物学
更具体地，涉及一种检测呼吸道病原体核酸的方法。
技术介绍
呼吸道感染性疾病常急性起病，以干咳、胸闷、呼吸困难等呼吸道症状为主要表现，并可伴有乏力、头痛、肌肉关节酸痛等全身症状，是全球发病和死亡的第二大常见病因。呼吸道病原诊断方法有镜检、细菌培养、抗原抗体检测、生化反应、分子生物学方法等。常用的诊断方法往往是基于经验判断或是单个病原体的检测，基于症候群的常见病原整体检测的产品很少。呼吸道常见感染病原菌有：分枝杆菌复合群(Mycobacteriumcomplex，MC)，百日咳博德特菌(Bordetellapertussis,BP)，肺炎衣原体(Chlamydophilapneumoniae,CP)。为实现呼吸道传染病的早期检测并控制其传播风险，开发低成本、准确、高效、快速地检测呼吸道传染病病原的诊断方法非常重要。经典的基于培养的表型试验测定易感性或抗性是临床微生物实验室中使用的一般方法，如病原体分离培养，特别是对于病原微生物和病毒的分离培养，是早期的病原体金标准鉴定技术。该方法存在对的问题主要有：分离培养耗时长，往往需要几天时间，无法实现短时间内迅速得到检测结果，且必须高度依赖检测实验室硬件及实验操作人员条件，且不适用于目前未有成熟培养手段的病原微生物和病毒的检测。(2)免疫学检测：以基于抗原-抗体的免疫反应，识别病原相关蛋白，从蛋白水平对病原体进行检测。该方法存在检测灵敏度较低，且特异性受环境等影响较大，检测的窗口期较长，无法满足诊疗需求，仅适用于初筛而不能作为及时确诊的依据，不能够识别同一类病原的不同亚型等问题。基于分子的诊断方法可以提高检测抗性基因的速度和准确性，这对医院和社区环境中的感染控制、预防、治疗很有意义。目前分子诊断方法主要是聚合酶链反应(PCR)：包括普通PCR、等位基因特异性PCR、实时荧光定量PCR、PCR-Sanger测序技术、PCR-基因芯片技术等。PCR是从核酸水平对病原体进行检测，整个实验需要1～2小时完成。该方法的主要缺点在于进行PCR检测时需要依赖PCR仪或昂贵的实时定量PCR仪，及其它多种配套设备，以及专门的PCR实验室和专业操作人员。PCR检测无法实现即时检验、床旁诊断和无特定实验室检测条件的场景应用，因此无法满足基层、用户终端、现场的检验需求。同时，PCR检测可能存在假阳性和灵敏度不足等问题。目前，基于CRISPR/Cas蛋白系统的基因检测、编辑显示出了较好的应用前景。然而正如合适靶标寻找并设计制备出精确、特异性靶向目标基因的gRNA是CRISPR/Cas9基因敲除的关键技术，合适靶标以及高效、特异性靶向gRNA也是基于CRISPR/Cas12a实现基因检测的关键。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有呼吸道病原检测技术的缺陷和不足，研究发现一系列基于CRISPR/Cas12a系统的呼吸道病原核酸检测位点，针对该系列位点利用CRISPR/Cas12a系统可实现呼吸道病原的核酸检测；并基于此构建了一种基于CRISPR/Cas12a系统的呼吸道病原的检测方法及检测试剂盒。本专利技术的目的是提供一种基于CRISPR/Cas12a系统的呼吸道病原核酸检测位点及gRNA组合。本专利技术另一目的是提供一套针对3种呼吸道病原的CRISPR/Cas12a检测系统。本专利技术再一目的是提供一种基于CRISPR/Cas12a系统的呼吸道病原核酸的检测方法。本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：本专利技术研究得到一组基于CRISPR/Cas12a系统的3种呼吸道病原核酸检测靶标位点，针对该位点可进行基于CRISPR/Cas12a系统的呼吸道病原核酸检测，检测特异性好、灵敏度高。所述3种呼吸道病原核酸检测靶标位点的序列如SEQIDNO.1-17任一所示。该靶标位点能特异性区分3种呼吸道病原的不同型别且包含Cas12a识别的PAM序列。同时所述靶标位点在作为呼吸道病原核酸检测位点方面的应用，以及作为基于CRISPR/Cas12a系统的呼吸道病原核酸检测位点方面的应用，均应在本专利技术的保护范围之内。基于上述研究成果，本专利技术还提供一种基于CRISPR/Cas12a系统的呼吸道病原检测方法，是利用CRISPR/Cas12a系统检测上述靶标位点。具体是利用Cas12a蛋白和对应所述靶标位点的gRNA进行CRISPR核酸检测。所述gRNA的设计原则为：在选取gRNA靶向序列时，靶向序列5’端应具有5’-TTTN-3’序列，且靶向序列本身、靶向序列和其余序列间不形成稳定二级结构。作为优选的可选择方案，所述gRNA的序列如SEQIDNO.18-55任一或任几个所示。该gRNA组合也应在本专利技术的保护范围之内。同时本专利技术还提供一种呼吸道病原核酸的CRISPR/Cas12a检测系统或试剂盒，包括Cas12a蛋白和gRNA，所述gRNA的序列对应于SEQIDNO.1-17任一所示靶标位点。优选地，所述gRNA的序列如SEQIDNO.18-55任一或任几个所示。另外，上述Cas12a蛋白为具有核酸内切酶活性且具有附属切割活性的Cas12a蛋白。比如LbCas12a、SsCas12a、ScCas12a、FnCas12a、AsCas12a等。所述ScCas12a的序列如SEQIDNO.56所示，所述SsCas12a的序列如SEQIDNO.57所示，所述LbCas12a的序列参照Addgene号pMAL-his-LbCpf1-EC(Plasmid#79008)，FnCas12a的序列参照Addgene号6-His-MBP-TEV-FnCpf1(Plasmid#90094)、AsCas12a的序列参照Addgene号AsCpf1-2NLS(Plasmid#102565)。本专利技术的检测方案可以针对分枝杆菌复合群(Mycobacteriumcomplex，MC)、百日咳博德特菌(Bordetellapertussis,BP)、肺炎衣原体(Chlamydophilapneumoniae,CP)特异性区分这3种病原的不同型别，同时实现多重检测，可用于呼吸道相关病原的检测筛查。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术研究发现了基于CRISPR/Cas12a系统的呼吸道病原核酸检测靶标位点，针对该位点利用CRISPR/Cas12a系统可实现呼吸道病原核酸检测，检测特异性好、灵敏度高，可在25-37℃的室温下实现高灵敏、高精度的分子检测，具有更好的特异性和兼容性，检测成本低廉、操作方便、快捷。检测限值可达到阿摩尔级(10-18摩尔/L)，实现靶标单分子检测，能特异性区分这3种病原的不同型别；同时还能实现多位点同时检测，临床检测效果优异，对于呼吸道病原的检测与筛查具有重要的意义。附图说明图1-3为LbCas12a对3种呼吸道病原的不同gRNA检测效果。图1为实施例2中对分枝杆菌复合群(MC)的不同靶标位点的gRNA检测效果。图2为实施例2中对百日咳博德特菌(BP)的不同靶标位点的gRNA检测效果。图3为实施例2中对肺炎衣原体(CP)的不同靶标位点的gRNA检测效果。图4为实施例4中8例结核分枝杆菌阳性的临床样本的检测效果。具体实施方式以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本专利技术，但本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于CRISPR/Cas12a系统的呼吸道病原检测方法，其特征在于，检测靶标位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑17任一或任几个所示。

【技术特征摘要】
1.一种基于CRISPR/Cas12a系统的呼吸道病原检测方法，其特征在于，检测靶标位点的核苷酸序列如SEQIDNO.1-17任一或任几个所示。2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，利用Cas12a蛋白和gRNA进行CRISPR核酸检测，所述gRNA以所述靶标位点为靶序列进行设计。3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述gRNA的序列如SEQIDNO.18-55任一或任几个所示。4.一种呼吸道病原核酸的CRISPR/Cas12a检测系统，其特征在于，包括Cas12a蛋白和gRNA，所述gRNA以SEQIDNO.1-17任一所示靶标位点为靶序列进行设计。...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘华勇，陈翀，杨嘉玉，
申请(专利权)人：广州普世利华科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44