本发明专利技术提供了副猪嗜血杆菌的血清分型方法、引物组合以及PCR体系，本发明专利技术为15种血清型的副猪嗜血杆菌分别设计特异性引物，序列为：SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.30，并将15对特异性引物分成六组，每组包括1至3对引物，每个PCR体系包括一组引物，整体构成一个多重PCR体系；后以待测血清型的副猪嗜血杆菌菌株基因组DNA为模板，分别使用上述六组引物进行PCR检测，结果和参考菌株条带进行比对。本发明专利技术通过将引物进行分组后进行多重PCR，使用6个PCR体系，比一般的PCR方法的15个体系大幅简化，节约鉴定血清型的成本，同时不同血清型的特异性条带区别明显，使得本发明专利技术可以准确鉴定出副猪嗜血杆菌的15种血清型。
Serotyping method, primer combination and PCR system of Haemophilus Haemophilus
【技术实现步骤摘要】
副猪嗜血杆菌的血清分型方法、引物组合以及PCR体系
本专利技术涉及分子生物学领域，尤其涉及副猪嗜血杆菌的血清分型方法、引物组合以及PCR体系。
技术介绍
副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis，HPS)是猪格拉瑟氏病的病原菌，一种革兰氏阴性菌，可引起猪的浆膜炎、脑膜炎和关节炎等炎症，给养殖业造成重大损失。HPS菌体在显微镜下可呈现多种形态，如球状、长杆状、或丝状，通常有荚膜，体外存活较难，其生长依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)。HPS的血清型众多，现在已知比较常见的有15种血清型，每种血清型毒力不同，相互之间缺乏交叉保护，因此需要针对不同的血清型制备不同的疫苗来预防HPS的感染，对HPS菌株血清型的鉴定就显得尤为重要。目前HPS的血清分型方法很多，比较常用的传统分型方法是琼脂扩散法(GD)和间接凝集试验(IHA)，但这两种方法耗时长、敏感性低、准确性不高，鉴定时所需要的标准阳性血清制备十分麻烦，购买的价格十分昂贵，而且都至少有20％的菌株不能分型。随着聚合酶链式反应(PCR)方法的兴起，很多学者开始在分子水平上探究HPS的血清分型方法。目前已有很多可用于HPS分型的PCR方法见于报道。由于HPS的血清型主要取决于荚膜合成基因簇控制合成的荚膜的抗原性，因此这种方法一般是基于荚膜合成基因簇设计血清特异性引物，再将菌株模板与不同的引物在PCR体系中扩增，根据扩增出的特异性条带对HPS进行分型，很少出现不能分型的菌株。这样的方法虽然比GD和IHA已经减少很多工作量，但其需要15个PCR体系，并且分型效率依然不高，而且由于5型和12型的荚膜合成基因簇完全一致，难以区分，因此大多数的PCR分型方法不能将5型和12型区分开，检出范围有限。综上所述，现有的HPS血清分型方法中，传统的GD和IHA法费时费力，准确性和灵敏性都不高，越来越难以满足研究和生产的需要，已有的PCR分型方法虽然在一定程度上能够克服传统分型方法的缺陷，但其分型效率仍待提高，并且不能完全区分15种血清型的副猪嗜血杆菌，尤其是5型和12型，存在很大的局限性。
技术实现思路
为克服上述副猪嗜血杆菌传统分型方法和现有PCR分型方法的缺陷，本方案设计了一种多重PCR的分型方法，可在高准确性、高灵敏性的基础上，减少时间和试剂成本，并可同时对大量菌株的血清型进行鉴定。第一方面，本专利技术提供一种副猪嗜血杆菌的血清分型方法，包括：为15种血清型的副猪嗜血杆菌每种设计一对特异性引物，序列为：SEQIDNO.1-SEQIDNO.30，所述15种血清型分别是副猪嗜血杆菌血清1-15型。将上述15对特异性引物进行分组：G1组包含SEQIDNO.1-2、SEQIDNO.11-12和SEQIDNO.27-28所示序列的特异性引物；G2组包含SEQIDNO.3-4、SEQIDNO.15-16和SEQIDNO.17-18所示序列的特异性引物；G3组包含SEQIDNO.5-6、SEQIDNO.13-14和SEQIDNO.25-26所示序列的特异性引物；G4组包含SEQIDNO.7-8、SEQIDNO.9-10和SEQIDNO.19-20所示序列的特异性引物；G5组包含SEQIDNO.21-22和SEQIDNO.29-30所示序列的特异性引物；G6组包含SEQIDNO.23-24所示序列的特异性引物；以待测血清型的副猪嗜血杆菌菌株基因组DNA为模板，分别使用上述六组引物进行PCR检测，结果和参考菌株条带进行比对。本领域技术人员能够理解，对于副猪嗜血杆菌的血清分型方法并非完全属于疾病诊断方法，在生物制品制备、生物制品质量控制领域，本专利技术的上述方法也具有良好的应用前景。优选地，当待测血清型的副猪嗜血杆菌菌株为2型时在G1泳道150bp和G2泳道295bp处有特异性条带。优选地，当待测血清型的副猪嗜血杆菌菌株为11型时G1泳道150bp和G5泳道468bp处都有特异性条带。优选地，当待测血清型的副猪嗜血杆菌菌株为5型时仅在G4泳道519bp处有特异性条带。优选地，当待测血清型的副猪嗜血杆菌菌株为12型时在G4泳道519bp和G6泳道532bp处有特异性条带。优选地，当待测血清型的副猪嗜血杆菌菌株为1型时在G1泳道150bp处有特异性条带。优选地，当待测血清型的副猪嗜血杆菌菌株为3型时在G3泳道397bp处有特异性条带。优选地，当待测血清型的副猪嗜血杆菌菌株为4型时在G4泳道347bp处有特异性条带。优选地，当待测血清型的副猪嗜血杆菌菌株为6型时在G1泳道550bp处有特异性条带。优选地，当待测血清型的副猪嗜血杆菌菌株为7型时在G3泳道484bp处有特异性条带。优选地，当待测血清型的副猪嗜血杆菌菌株为8型时在G2泳道699bp处有特异性条带。优选地，当待测血清型的副猪嗜血杆菌菌株为9型时在G2泳道419bp处有特异性条带。优选地，当待测血清型的副猪嗜血杆菌菌株为10型时在G4泳道942bp处有特异性条带。优选地，当待测血清型的副猪嗜血杆菌菌株为13型时在G3泳道685bp处有特异性条带。优选地，当待测血清型的副猪嗜血杆菌菌株为14型时在G1泳道975bp处有特异性条带。优选地，当待测血清型的副猪嗜血杆菌菌株为15型时在G5泳道287bp处有特异性条带。优选地，PCR扩增条件如下：10μL反应体系：2×PremixTaq5μL，10mmol/mL引物各0.4μL，模板DNA0.5μL，然后加入无菌双蒸水或超纯水补足至10μL；PCR反应程序：95℃预变性5min；然后95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，进行30个循环；72℃延伸10min。电泳成像条件：用1％浓度的琼脂糖凝胶在150V电压下电泳20min，凝胶成像系统观察每组引物扩增的目的条带大小。第二方面，本专利技术提供了一种用于副猪嗜血杆菌血清分型的引物组合，分组方式如下：第一组包含SEQIDNO.1-2、SEQIDNO.11-12和SEQIDNO.27-28所示核苷酸序列；第二组包含SEQIDNO.3-4、SEQIDNO.15-16和SEQIDNO.17-18所示核苷酸序列；第三组包含SEQIDNO.5-6、SEQIDNO.13-14和SEQIDNO.25-26所示核苷酸序列；第四组包含SEQIDNO.7-8、SEQIDNO.9-10和SEQIDNO.19-20所示核苷酸序列；第五组包含SEQIDNO.21-22和SEQIDNO.29-30所示核苷酸序列；第六组包含SEQIDNO.23-24所示核苷酸序列。第三方面，本专利技术提供了一种血清分型方法和引物组合在制备副猪嗜血杆菌检测试剂盒或诊断试剂中的应用。第四方面，本专利技术提供了一种用于副猪嗜血杆菌血清分型的多重PCR体系，包括SEQIDNO.1-30所示核苷酸序列的DNA片段。与已有的HPS分型方法相比，本专利技术的有益效果如下：1、本方案所提供的HPS的多重PCR分型方法可在短时间内实现对HPS血清型的鉴定，相比与传统的GD和IHA法更简便快捷，可省去大量的人力物力，节约鉴定血清型的成本。2、本方案所提供的对HPS的多重PCR分型方法使用6个PCR体系，相比于现有PCR方法的15个体系大幅简化，同时10μLPCR体系所使用的试剂更少，效率更高。3、本方案所本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.副猪嗜血杆菌的血清分型方法，其特征在于，包括：为15种血清型的副猪嗜血杆菌HPS每种设计一对特异性引物，序列为：SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.30，将上述15对特异性引物进行分组：G1组包含SEQ ID NO.1‑2、SEQ ID NO.11‑12和SEQ ID NO.27‑28所示序列的特异性引物；G2组包含SEQ ID NO.3‑4、SEQ ID NO.15‑16和SEQ ID NO.17‑18所示序列的特异性引物；G3组包含SEQ ID NO.5‑6、SEQ ID NO.13‑14和SEQ ID NO.25‑26所示序列的特异性引物；G4组包含SEQ ID NO.7‑8、SEQ ID NO.9‑10和SEQ ID NO.19‑20所示序列的特异性引物；G5组包含SEQ ID NO.21‑22和SEQ ID NO.29‑30所示序列的特异性引物；G6组包含SEQ ID NO.23‑24所示序列的特异性引物；以待测血清型的副猪嗜血杆菌菌株基因组DNA为模板，分别使用上述六组引物进行PCR检测，结果和参考菌株条带进行比对。
【技术特征摘要】
1.副猪嗜血杆菌的血清分型方法，其特征在于，包括：为15种血清型的副猪嗜血杆菌HPS每种设计一对特异性引物，序列为：SEQIDNO.1-SEQIDNO.30，将上述15对特异性引物进行分组：G1组包含SEQIDNO.1-2、SEQIDNO.11-12和SEQIDNO.27-28所示序列的特异性引物；G2组包含SEQIDNO.3-4、SEQIDNO.15-16和SEQIDNO.17-18所示序列的特异性引物；G3组包含SEQIDNO.5-6、SEQIDNO.13-14和SEQIDNO.25-26所示序列的特异性引物；G4组包含SEQIDNO.7-8、SEQIDNO.9-10和SEQIDNO.19-20所示序列的特异性引物；G5组包含SEQIDNO.21-22和SEQIDNO.29-30所示序列的特异性引物；G6组包含SEQIDNO.23-24所示序列的特异性引物；以待测血清型的副猪嗜血杆菌菌株基因组DNA为模板，分别使用上述六组引物进行PCR检测，结果和参考菌株条带进行比对。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，当所述待测血清型的副猪嗜血杆菌菌株为2型时在G1泳道150bp和G2泳道295bp处有特异性条带。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，当所述待测血清型的副猪嗜血杆菌菌株为11型时G1泳道150bp和G5泳道468bp处都有特异性条带。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，当所述待测血清型的副猪嗜血杆菌菌株为5型时仅在G4泳道519bp处有特异性条带。5.根据权利要求1所述的方法，其...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐高原，王召贺，汤细彪，周明光，郝根喜，张华伟，
申请(专利权)人：武汉科前生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42
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