一种用于检测沙门氏菌的生物传感器及方法技术

本发明专利技术涉及分子生物学技术领域，特别涉及一种用于检测沙门氏菌的生物传感器及方法。该生物传感器包括RPA反应试剂、Lambda核酸外切酶切割反应试剂、HCR反应试剂和显色试剂。本发明专利技术通过多酶系统对沙门氏菌的双链核酸进行扩增，得到在5’端磷酸化的dsDNA。Lambda外切酶消化dsDNA中的5’‑磷酸化链，RPA产物变成单链。通用接头被暴露出来，启动HCR反应，释放出的G‑四联体与Hemin结合，形成G4 DNAzyme，可催化H2O2将无色的TMB氧化为肉眼可见的蓝色oxTMB，进而通过颜色变化和吸光值的改变对沙门氏菌进行检测。本发明专利技术具有可视化、通用性、快速和高敏感性等特点。

A Biosensor and Method for Detecting Salmonella

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测沙门氏菌的生物传感器及方法
本专利技术涉及分子生物学
，特别涉及一种用于检测沙门氏菌的生物传感器及方法。
技术介绍
沙门氏菌病是指由各种类型沙门氏菌所引起的对人类、家畜以及野生禽兽不同形式的疾病的总称。感染沙门氏菌的人或带菌者的粪便污染食品，可使人发生食物中毒。据统计在世界各国的种类细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首。目前沙门氏菌的检测技术主要依靠酶联免疫技术、DNA分子核酸探针或基因探针技术、生化鉴定技术、生物传感器技术。生物传感器技术相对于传统的检测方法最主要的优点是其有很高的灵敏度，能高灵敏的对靶标物质进行检测，这主要是由于其对检测信号进行了放大，信号放大方式主要包括两种：一种是基于工具酶的核酸扩增技术，如PCR技术、RCA技术、SDA技术和RPA技术等。另一种是不依赖酶信号放大技术，如杂交链式反应(HCR反应)。相对于以上提到过的一系列扩增技术，HCR最大的不同点是不需要酶的参与就可发生反应。杂交链式反应是一种体外自组装的信号放大技术，是Dirks等人在2004年首次提出的。它的原理是利用一条单链DNA引发两个不同核酸发夹交替识别，发生杂交反应，形成超长的dsDNA纳米线，使传感信号放大。HCR的操作简单，成本较低且具有很好的兼容性，将杂交链式反应与其他技术相结合，可以构建很多生物传感器，如电化学传感器、荧光生物传感器、侧流层析生物传感器、可视化生物传感器等，实现对核酸、蛋白等生物分子的检测。目前，基于HCR的沙门氏菌检测技术较为鲜见。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种用于检测沙门氏菌的生物传感器及方法。本专利技术具有可视化、通用性、快速和高敏感性等特点。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种用于检测沙门氏菌的生物传感器，包括RPA反应试剂、Lambda核酸外切酶切割反应试剂、HCR反应试剂和显色试剂；RPA反应试剂包括缓冲液、序列如SEQIDNO：1所示的上游引物、序列如SEQIDNO：2所示的下游引物、序列如SEQIDNO：3所示的通用引物、乙酸镁和水。在HCR技术中，核酸扩增产物大多为dsDNA，由于dsDNA具有很高的稳定性，很难与其他技术结合，兼容性和检测灵敏度都较低。相比之下，ssDNA具有更高的杂交效率和检测灵敏度。因此，如何实现dsDNA向ssDNA的转化一直是科学家们关注的热点问题。Lambda核酸外切酶可以完成这一转化，其作用于双链DNA，沿着5’-3’方向逐步切去5’单核苷酸。最适底物是5’磷酸化的双链DNA，也可以缓慢降解单链DNA和非磷酸化底物，但5’-OH端的切割速度比5’-PO4端慢约20倍，消化单链DNA比双链DNA慢100倍左右。作为特异性功能性核酸，富含鸟嘌呤(G)的序列与氯高铁血红素(Hemin)组合时可形成配位络合物(G4DNAzyme)，其具有类过氧化物酶催化活性。该复合物的催化活性比单独的Hemin高约10倍，显着改善了Hemin本身的催化性能。G4DNAzyme已广泛用于催化H2O2调节的氧化还原反应。例如，它可催化H2O2将无色的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)氧化为蓝色的氧化TMB(oxTMB)。该显色原理简单、快速且不需要酶催化，已广泛应用于比色生物传感器的构建。本专利技术提供一种沙门氏菌检测方法，将重组酶、聚合酶和lambda核酸外切酶的组合(RPL原则)和杂交链式反应(HCR)相结合，构建了一种基于通用接头触发G-四联体嵌合HCR的双重信号放大的无标记可视化生物传感器检测沙门氏菌。通过多酶系统对沙门氏菌的双链核酸进行扩增，得到大量在5’端磷酸化的dsDNA。为了得到大量带有磷酸化的扩增产物，在RPA反应体系中加入了一段5’末端被磷酸化的通用序列，并且把这段通用序列的互补链命名为通用接头。Lambda外切酶选择性地消化dsDNA中的5’-磷酸化链，在不需要的链被消化后，RPA产物变成单链。通用接头被暴露出来，启动HCR反应，H1发夹中的G-四联体被释放出来。G-四联体可以与Hemin结合，形成具有过氧化物酶活性的G4DNAzyme。这种模拟酶可催化H2O2将无色的TMB氧化为肉眼可见的蓝色oxTMB，进而通过颜色变化和吸光值的改变对沙门氏菌进行检测。在本专利技术中，序列如SEQIDNO：2所示的下游引物为5’端磷酸化的序列如SEQIDNO：2所示的下游引物。在本专利技术中，序列如SEQIDNO：3所示的通用引物为5’端磷酸化的序列如SEQIDNO：3所示的通用引物。在本专利技术中，Lambda核酸外切酶切割反应试剂包括Lambda核酸外切酶、缓冲液和水。在本专利技术中，HCR反应试剂包括发夹H1、发夹H2和缓冲液。作为优选，发夹H1序列如SEQIDNO：4所示，发夹H2序列如SEQIDNO：5所示。在本专利技术中，显色试剂包括缓冲液、Hemin、TMB显色剂和H2SO4。在本专利技术中，TMB显色剂中含有TMB和H2O2。本专利技术还提供了一种沙门氏菌的检测方法，采用上述生物传感器检测沙门氏菌，包括RPA反应、Lambda核酸外切酶反应、HCR反应和显色反应。作为优选，RPA反应的体系如下：优选地，RPA反应的体系如下：作为优选，RPA反应的条件为：38～40℃反应18～22min。优选地，RPA反应的条件为：39℃反应20min。作为优选，Lambda核酸外切酶反应的体系为：优选，Lambda核酸外切酶反应的体系为：作为优选，Lambda核酸外切酶反应的条件为：36～38℃反应18～22min。优选地，Lambda核酸外切酶反应的条件为：37℃反应20min。作为优选，HCR反应的体系为：优选地，HCR反应的体系为：作为优选，HCR反应的条件为：36～38℃反应28～32min。优选地，HCR反应的条件为：37℃反应30min。作为优选，显色反应的体系为：优选地，显色反应的体系为：作为优选，显色反应的条件：HCR反应产物、Hemin、缓冲液在36～38℃下孵育19～21min，加入TMB显色剂后在36～38℃下显色4～6min，最后加入H2SO4终止反应。优选地，显色反应的条件：HCR反应产物、Hemin、缓冲液在37℃下孵育20min，加入TMB显色剂后在37℃下显色5min，最后加入H2SO4终止反应。本专利技术提供了一种用于检测沙门氏菌的生物传感器及方法。该生物传感器包括RPA反应试剂、Lambda核酸外切酶切割反应试剂、HCR反应试剂和显色试剂；RPA反应试剂包括缓冲液、序列如SEQIDNO：1所示的上游引物、序列如SEQIDNO：2所示的下游引物、序列如SEQIDNO：3所示的通用引物、乙酸镁和水。本专利技术基于两种恒温扩增技术的可视化的检测沙门氏菌的生物传感器具有以下优点：(1)通用接头的设计：经过RPA扩增后可以生成大量带有通用接头的dsDNA。经过lambda核酸外切酶的切割，可实现dsDNA向ssDNA的转化，将不需要的DNA链消化后，通用接头暴露出来以实现对HCR的触发。(2)dsDNA转化为ssDNA：双链RPA产物被Lambda外切酶消化成ssDNA，使dsDNA实现向ssDNA的转化。(3)可视化：HCR反应发生后，包含G-四联体结构的H1发夹被打开。在交替打开发夹的过程中有大本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测沙门氏菌的生物传感器，其特征在于，包括RPA反应试剂、Lambda核酸外切酶切割反应试剂、HCR反应试剂和显色试剂；所述RPA反应试剂包括缓冲液、序列如SEQ ID NO：1所示的上游引物、序列如SEQ ID NO：2所示的下游引物、序列如SEQ ID NO：3所示的通用引物、乙酸镁和水。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测沙门氏菌的生物传感器，其特征在于，包括RPA反应试剂、Lambda核酸外切酶切割反应试剂、HCR反应试剂和显色试剂；所述RPA反应试剂包括缓冲液、序列如SEQIDNO：1所示的上游引物、序列如SEQIDNO：2所示的下游引物、序列如SEQIDNO：3所示的通用引物、乙酸镁和水。2.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述Lambda核酸外切酶切割反应试剂包括Lambda核酸外切酶、缓冲液和水。3.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述HCR反应试剂包括发夹H1、发夹H2和缓冲液。4.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述发夹H1序列如SEQIDNO：4所示，发夹H2序列如SEQIDNO：5所示。5.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述显色试剂包括缓冲液、Hemin、TMB显色剂和H2SO4。6.一种沙门氏菌的检测方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：许文涛，田洪涛，罗云波，张媛，李舒婷，田晶晶，朱龙佼，杜再慧，
申请(专利权)人：中国农业大学，河北农业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11