一种游离型非甲醇诱导毕赤酵母表达载体的构建及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种游离型非甲醇诱导毕赤酵母表达载体的构建及其在酶重组表达中的应用，属于基因工程技术领域。本发明专利技术所述非甲醇诱导毕赤酵母表达载体是将乳酸克鲁维酵母自主复制序列PARS2和毕赤酵母启动子PGCW14序列插入载体骨架，属于带自我复制序列的游离型载体构建得到的。利用该载体构建的游离型重组毕赤酵母工程菌相对通用的整合型重组毕赤酵母工程菌，分泌生产重组酶的能力显著提升。此外，其发酵原料来源广泛，生产成本较低。

Construction and application of a free non-methanol-induced Pichia pastoris expression vector

【技术实现步骤摘要】
一种游离型非甲醇诱导毕赤酵母表达载体的构建及其应用
本专利技术涉及一种游离型非甲醇诱导毕赤酵母表达载体的构建及其应用，属于基因工程

技术介绍
毕赤酵母表达系统主要包括诱导型表达系统和组成型表达系统。诱导型表达系统中常使用启动子为甲醇代谢启动子PAOX1，通过甲醇诱导的表达系统相对于组成型表达系统也有自身的一些劣势。第一，生产时间长，毕赤酵母系统所使用的诱导剂为甲醇，而毕赤酵母对甲醇的利用率和同化效率都较低，其菌体生物量在诱导阶段增长十分缓慢，过量的甲醇积累甚至会对菌体产生一定毒性，与此相应，目标蛋白在诱导阶段的积累速度也较慢，导致生产时间较长。第二，毕赤酵母为好氧微生物，甲醇的代谢也需要大量的氧气，这直接导致溶氧成为生产过程中的限制因素。第三，毕赤酵母在表达外源蛋白时需要大量甲醇作为碳源和诱导剂，大量甲醇的长时间储存带来了安全隐患，另外，甲醇还属于剧毒物质，不适用于食品方面的应用，因而制约了PAOX1表达载体在食品领域的大规模应用。组成型表达系统是最近几年广泛使用的毕赤酵母表达系统，其中三磷酸甘油醛脱氢酶启动子(PGAP)是较为常用的同生长相偶联的组成型表达系统启动子，可以本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种游离型非甲醇诱导的毕赤酵母表达载体，其特征在于，所述游离型非甲醇诱导的毕赤酵母表达载体是将自主复制序列PARS2和毕赤酵母启动子PGCW14序列插入载体骨架，构建获得的游离型非甲醇诱导表达载体，所述自主复制序列PARS2含SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，所述启动子PGCW14含SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种游离型非甲醇诱导的毕赤酵母表达载体，其特征在于，所述游离型非甲醇诱导的毕赤酵母表达载体是将自主复制序列PARS2和毕赤酵母启动子PGCW14序列插入载体骨架，构建获得的游离型非甲醇诱导表达载体，所述自主复制序列PARS2含SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，所述启动子PGCW14含SEQIDNO:2所示的核苷酸序列。2.如权利要求1所述的毕赤酵母表达载体，其特征在于，所述毕赤酵母表达载体为pGCW14ZαA-PARS2，所述pGCW14ZαA-PARS2是将质粒pGAPZαA中的PGAP启动子替换成启动子PGCW14，再将核苷酸序列如SEQIDNO:1的PARS2复制子连接到pGCW14ZαA质粒上得到游离型非甲醇诱导毕赤酵母表达载体pGCW14ZαA-PARS。3.含有权利要求1或2所述毕赤酵母表达载体的细胞。4.如权利要求3所述的细胞，其特征在于，表达了氨基酸序列如SEQIDNO.7所示的木聚糖酶。5.如权利要求3所述的细胞，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴敬，胡梦凯，夏伟，吴丹，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32