一种人源溶菌酶蛋白发酵方法技术

本发明专利技术属于基因工程和发酵工程领域，提供了一种人源溶菌酶蛋白发酵方法，将表达人源溶菌酶的种子发酵液加入发酵罐进行高密度发酵；所述的高细胞密度发酵包括甲醇诱导、添加胰蛋白胨和甘油补料；发酵罐高密度发酵采用BSM发酵培养基，接种5％的种子培养液。利用本发明专利技术的方法获得的人源溶菌酶，活性最高分别为151600U/mL和127300U/mL，蛋白表达量最高达1.65g/L，且批次具有较好的稳定性。放大结果理想，为工业化生产提供了实际参考依据。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程和发酵工程领域，具体而言，本专利技术涉及一种发酵人源溶菌酶蛋白的生产工艺方法的应用。
技术介绍
感染性疾病一直是人类健康和生命的主要威胁，目前对于细菌性感染，抗生素及人工合成抗菌药物仍是最主要的治疗手段。然而进入21世纪后，不断出现的多重耐药细菌使感染性疾病的治疗困难重重，如甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(MRSA)、万古霉素耐药肠球菌(VRE)、青霉素耐药肺炎链球菌(PRSP)、泛耐药(PDR)铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌等各种超级耐药细菌的出现。因此寻找和开发与传统抗生素结构与作用机制以及作用靶位不同的抗菌药物已是当务之急。溶菌酶(Lysozyme)是一种水解酶，它能够水解细菌细胞壁中肽聚糖的糖苷键，又称胞壁质酶。该酶由129个氨基酸残基组成的碱性球蛋白，作用机理是切断肽聚糖中N-乙酰胞壁酸(NAM)与N-乙酰葡萄糖胺(NAG)之间的β-1，4-糖苷键之间的联结，破坏肽聚糖支架，在内部渗透压的作用下细胞胀裂开，引起细菌裂解。溶菌酶在自然界中分布广泛，按照溶菌酶的不同物种来源，可分为：鸡型(c-型，chicken type)、鹅型(g-型，goose type)、无脊椎动物型(i-型，invertebrate type)、噬菌体溶菌酶、植物溶菌酶和细菌溶菌酶。在人体中同时存在鸡型和鹅型，也就是常说的c-型和g-型两种溶菌酶，其中c-型溶菌酶的研究最为广泛，因为它是唯一同时在脊椎动物、无脊椎动物和原索动物中存在的。c-型溶菌酶是大部分脊柱动物(包括哺乳动物)产生的主要溶菌酶，是作为酶结构和功能研究模型的原型溶菌酶。溶菌酶是一种具有杀菌作用的天然物质，它具有耐热、耐酸的理化特性，可溶于水、乙醇、油脂类溶剂，通过裂解细胞壁而达到裂解革兰氏阳性细菌的效果。对溶菌酶杀菌能力研究表明：极微量的溶菌酶即可杀灭溶壁微球菌、藤黄球菌、巨大芽孢杆菌、棒状杆菌、乳酸杆菌、细球菌、八迭球菌、葡萄球菌等自然界常见细菌。目前市场上的溶菌酶产品大多以蛋清溶菌酶为主要原料，因为鸡蛋清溶菌酶的提取工艺相对成熟，价格便宜，如上世纪80年代初上市的溶菌酶肠溶片、含片，我国SFDA已下达13个鸡溶菌酶肠溶片生产文号、16个含片生产文号。鸡溶菌酶产品在广州、上海、杭州的用量较大，分别占中国市场本品的56.55％、14.93％和9.25％。除了应用在医药行业，鸡溶菌酶在日化行业也得到了应用，如口腔护理产品牙膏、漱口液、喷剂，化妆品等。但是，鸡蛋清溶菌酶对于人体而言是一种异源蛋白，在蛋白质一级结构上与人溶菌酶有较大差异，因此，它具有明显的局限性。鸡溶菌酶用于过敏体质人群时，可引发过敏反应，严重者可导致死亡。另外，鸡溶菌酶在人体内会产生免疫原性与毒副作用，无法用于静脉用药，对于侵入机体内的细菌、病毒无法产生抑制和杀灭作用。由于鸡溶菌酶的局限性，人们开始更加关注人溶菌酶(human lysozyme，h-LYZ)的研究和开发。人溶菌酶是在人奶汁中发
现的抗菌剂之一，且广泛存在于人的体液、细胞和组织器官中，如脾脏，肺脏，肾脏，白细胞，血浆，唾液和眼泪等。我们可以从人奶、胎盘或尿液中少量提取人溶菌酶，但制备材料相当有限，制备成本非常高，因此在医药、日化、食品、饲料添加剂等行业都没得到广泛应用。人溶菌酶与其他来源的溶菌酶相比，有许多无法逾越的优势，如酶活性是蛋清溶菌酶的3倍，并且人溶菌酶来源于人体，和人体具有天然相容性，不会产生任何副作用和免疫原性。目前全球最大最著名的sigma-aldrich生物/化学试剂公司(http：//www.sigma-aldrich.com)出售的基因工程人溶菌酶(活性≥100ku/mg)，售价478.53元/g，价格昂贵，只供各类研究机构使用。此外，从生物材料提取溶菌酶有其固有缺陷，一是受生物材料来源限制，二是生物材料由于取自不同生物体，保鲜程度不一，难以保证不受病毒和其他有害物质污染，这会造成产品质量不稳定。溶菌酶巨大的市场前景(主要有饲料市场、食品添加剂市场、化妆品市场和人用医药市场)也预示着，研究与开发人源溶菌酶(h-LYZ)势在必行。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种操作简便、成本低廉、产品纯度高的人溶菌酶发酵方法，以达到工艺周期短、收率高，易于线性放大至生产规模的目的。为了解决上述技术问题，本专利技术构建毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统及由酿酒酵母α-因子信号肽引导表达具有天然N端h-LYZ的重组pPIC9k-LYC6分泌型毕赤酵母表达载体，获得具有稳定整合表达载体的多拷贝插入菌株。通过摇瓶培养和诱导表达，初步筛选出蛋白表达量和活性较高的菌株，然后，利用Design-expert软件，依据响应面分析法对发酵条件进行优化，最后，在15L发酵罐中进行初步发酵，同时确定了最佳诱导pH值。本专利技术反复测试并优化了高细胞密度发酵的工艺研究。在菌体生长阶段，采用不同的甘油补料方式(周期补料、恒速流加、指数流加及反馈补料-恒溶氧(DO-stat)流加)，进行高密度发酵；在甲醇诱导阶段分别共混流加甘油、山梨醇、甘露醇和乳酸，研究了不同混合碳源对P.pastoris生长和h-LYZ蛋白表达的影响；防止外源蛋白降解策略研究，主要考察在诱导后期补加胰蛋白胨是否能有效防止蛋白降解；最后，在50L和500L发酵罐中进行放大，h-LYZ活性最高分别为151600U/mL和127300U/mL，蛋白表达量最高1.65g/L，且批次具有较好的稳定性。本专利技术提供了一种人源溶菌酶蛋白的大规模工业化发酵方法，将表达人源溶菌酶的种子发酵液加入发酵罐进行高密度发酵。其中，表达人源溶菌酶的种子发酵液是通过人源溶菌酶的酵母表达体系构建、定点整合至酵母基因组以及小规模发酵获得。所述的人源溶菌酶的核酸序列源自NCBI网站数据库登录号为NM_000239.2。所述的人源溶菌酶的酵母表达体系构建是以源自NCBI网站数据库登录号为NM_000239.2为基础，人工合成了去除自身信号肽的人源溶菌酶基因序列，并依据酵母偏爱
密码子构建由酿酒酵母α-因子信号肽引导表达具有天然N端人源溶菌酶的重组分泌型毕赤酵母载体。构建人源溶菌酶的分泌型毕赤酵母的载体为pPIC9k。所述的定点整合是指将线性化重组质粒分别电转入GS115和/或SMD1168中。毕赤酵母感受态细胞的电转化具体步骤为：取重悬在ice-cold 1M sorbitol中的酵母感受态细胞80μL(约1010cells/mL)与3μg的线性化DNA混合，冰上放置5min(注意：质粒的体积应控制在10μL以内，体积太大会影响转化效率)。将混合物加入ice-cold的0.2cm电转杯中。电转参数为：电压2000V，电容25uF，电阻200Ω，电转时间5ms。转化结束后，立即加入0.5mL的ice-cold 1M sorbitol混匀。从电转杯中将液体吸出，转移到Eppendorf管中，30℃静置1小时。然后加入1mL YDP培养基，30℃，振荡培养4小时，取适量菌液涂布于MD平板。同时转化空质粒pPIC9k作为表达的阴性对照。Mut+和Muts转化子筛选的具体步骤为：挑取MD平板上的His+转化子200个，接种至含有200μL YPD的9本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人源溶菌酶蛋白发酵方法，其特征在于，该人源溶菌酶蛋白发酵方法为将表达人源溶菌酶的种子发酵液加入发酵罐进行高密度发酵；所述的高密度发酵包括甲醇诱导、添加胰蛋白胨和甘油补料；发酵罐高密度发酵采用BSM发酵培养基，接种5％的种子培养液；所述的BSM发酵培养基的配方为：磷酸26.7mL，CaSO40.93g，K2SO418.2g，MgSO4.7H2O 14.9g，KOH 4.13g，甘油40g，PTM14mL，泡敌1mL；加水至1L定容；其中，PTM1溶液的配方为：CuSO4.5H2O 6g，KI 0.08g，MnSO4.H2O 3g，Na2MoO4.2H2O0.2g，H3BO30.02g，ZnSO4.7H2O 20g，FeSO4.7H2O 65g，CoCl2.6H2O 0.916g，H2SO45mL，Biotin 0.2g，加水至1L定容。

【技术特征摘要】
2014.11.18 CN 20141065765411.一种人源溶菌酶蛋白发酵方法，其特征在于，该人源溶菌酶蛋白发酵方法为将表达人源溶菌酶的种子发酵液加入发酵罐进行高密度发酵；所述的高密度发酵包括甲醇诱导、添加胰蛋白胨和甘油补料；发酵罐高密度发酵采用BSM发酵培养基，接种5％的种子培养液；所述的BSM发酵培养基的配方为：磷酸26.7mL，CaSO40.93g，K2SO418.2g，MgSO4.7H2O 14.9g，KOH 4.13g，甘油40g，PTM14mL，泡敌1mL；加水至1L定容；其中，PTM1溶液的配方为：CuSO4.5H2O 6g，KI 0.08g，MnSO4.H2O 3g，Na2MoO4.2H2O0.2g，H3BO30.02g，ZnSO4.7H2O 20g，FeSO4.7H2O 65g，CoCl2.6H2O 0.916g，H2SO45mL，Biotin 0.2g，加水至1L定容。2.如权利要求1所述的人源溶菌酶蛋白发酵方法，所述的人源溶菌酶的核酸序列源自NCBI网站...

【专利技术属性】
技术研发人员：江松敏，余龙，余文博，于颖，曹立环，陶建军，唐丽莎，杨鲜梅，赛音，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：上海;31