利用酵母组装多个基因片段到py-2u载体的方法及用途技术

本发明专利技术公开一种利用酵母组装多个基因片段到py‑2u载体的方法及用途，涉及生物工程技术领域。该方法在需要克隆的目的基因两段添加和py‑2u载体同源的同源序列；将得到的基因分为多个小片段，两段添加单独的酶切位点；每个小片段两端的酶切位点为同一个酶切位点，或不同的单独的酶切位点；每个小片段通过基因合成或PCR扩增得到，产物平端连接到克隆载体或TA克隆到小片段载体；将每个片段用单独的酶切位点进行酶切，回收产物后用于下一步的酵母转化。构建的Py‑2uL可被阿拉伯糖诱导提高其在大肠杆菌中的拷贝数，有利于后续的质粒提取等基因操作；可以稳定快速完成长基因的基因合成和组装，相较常规克隆流程更简便，经济高效。

The Method and Application of Assembly Multiple Gene Fragments into py-2u Vector by Yeast

【技术实现步骤摘要】
利用酵母组装多个基因片段到py-2u载体的方法及用途
本专利技术涉及生物工程
，具体涉及一种利用酵母组装多个基因片段到py-2u载体的方法及用途。
技术介绍
合成生物学在生物医药、生物燃料、精细化学品和农业等领域具有极大用途潜力，随着合成生物学的飞速发展，已经逐步进入全基因组合成时代，合成基因组学的技术意义重大。DNA基因组克隆组装技术是重要的分子生物学工具，对大片段DNA元件的快速有效组装起到关键性作用。DNA合成是支撑合成生物学发展的核心技术，它不依赖于DNA模板，可根据已知的DNA序列直接合成，在基因及生物元件的合成、基因回路和生物合成途径的重新设计组装，以及全基因组的人工合成中发挥重大作用。申请号201310389392.0的专利公开了一种多片段DNA的酵母快速组装方法，包括以下步骤：(1)将多个含有同源臂的DNA分子与线性化的酵母穿梭载体共转化酵母；(2)将整个筛选培养板上的全部转化后的酵母菌落洗脱下来，离心，弃上清，得到转化后的酵母菌细胞；(3)提取酵母菌细胞的质粒DNA，转化大肠杆菌感受态细胞；(4)筛选大肠杆菌克隆，得到大片段DNA。本专利技术的方法组装大片段DNA分子的速度快、简便可行、成功率高、成本低，效率高、易操作，可将多个小片段DNA分子组装成一个大片段DNA分子。由于化学合成的DNA片段长度有限，要合成长的DNA片段需要先合成短的寡核苷酸，然后再将寡核苷酸进行拼接。因此，基因组合成的基本思路为：①按照原始基因组序列设计合成寡核苷酸；②利用各种方法将寡核苷酸拼接成较长的DNA序列；③以较长的序列为基础，进一步拼接得到更长的DNA序列，拼接成完整的基因组；④将合成的基因组移植到细胞中，并验证其功能。传统的大片段克隆技术获取目的大片段的技术存在各种缺陷，比如随机建库克隆需要依靠高通量筛选；聚合酶链式反应(PCR)难以扩增10kb以上片段，从小片段拼装费时费力且突变率高；基于限制性酶切连接难以找到片段两端适宜的限制性内切酶酶切位点。
技术实现思路
为了解决上述的技术问题，本专利技术的目的在于提供一种利用酵母组装多个基因片段到py-2u载体的方法及用途，构建的Py-2uL可被阿拉伯糖诱导提高其在大肠杆菌中的拷贝数，有利于后续的质粒提取等基因操作；可以稳定快速完成长基因的基因合成和组装，包括基因组的组装，相较常规克隆流程更简便，经济高效。本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：本专利技术提供一种利用酵母组装多个基因片段到py-2u载体的方法，包括以下步骤：S1、在需要克隆的目的基因两段添加和py-2u载体同源的长度40-60bp的同源序列；S2、将步骤S1得到的基因分为多个小片段，两段添加单独的酶切位点；每个小片段两端的酶切位点为同一个酶切位点，或不同的单独的酶切位点；S3、每个小片段通过基因合成或PCR扩增得到，产物平端连接到克隆载体或TA克隆到小片段载体；S4、将每个片段用所述单独的酶切位点进行酶切，回收产物后用于下一步的酵母转化。作为本专利技术进一步的方案，步骤S4酵母转化的具体步骤如下：1)挑平板上的酵母单克隆摇菌，于4mL液体YPD培养基培养过夜，次日将2mL培养基转移至50mL液体YPD培养基继续培养4-6h，至OD达到0.5-0.8；将菌液收集并离心沉淀，加0.1M醋酸锂溶液重悬用于转化；2)将DNA片段和线性化载体加入上一步骤得到的酵母菌；3)将DMSO-醋酸锂-PEG加入上一步液体，混匀，放入恒温孵育装置进行孵育处理，关闭密闭门，开启伺服电机，伺服电机进一步带动转轴、多试管安装板的转动，使得样品发生高速搅拌，促进试管中样品的离心混合；4)离心后弃上清，用ddH2O重悬细胞，涂板，涂布于SC-TRP平板，30℃培养2-3天。作为本专利技术进一步的方案，步骤2)中每个DNA片段的添加量按摩尔比例1:1添加，各添加50-100ng，线性化载体添加200-500ng。作为本专利技术进一步的方案，步骤3)孵育处理的条件为37℃孵育30min，42℃反应30min。作为本专利技术进一步的方案，所述Py-2u载体包括高拷贝类型Py-2uH和低拷贝类型Py-2uL。作为本专利技术进一步的方案，PY-2u载体的同源序列分别为：(1)同源序列1：TGAGCCcgccagggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagt；(2)同源序列2：atcggatgccgggaccgacgagtgcagaggcgtgcaagcgagcgtcgacGC。本专利技术还提供一种利用酵母组装多个基因片段到py-2u载体的方法的用途，该方法用于长基因的基因合成和基因组装，该基因组装包括基因组的组装。作为本专利技术进一步的方案，基因组装的质粒构建步骤如下：(1)将带有目标载体同源序列的基因全长克隆到Py-2u；(2)酶切全长基因并通过Gibson重组重组到目标载体。本专利技术的有益效果：1、本专利技术利用酵母组装多个基因片段到py-2u载体的方法，区别于常规的酵母大肠穿梭载体，构建的Py-2uL可被阿拉伯糖诱导提高其在大肠杆菌中的拷贝数，有利于后续的质粒提取等基因操作。未诱导状态时大肠中为单拷贝，这样的特点令其可以克隆10-200Kb的基因，包括不稳定的病毒基因组。2、应用酵母组装多个基因片段到py-2u载体的方法，可以稳定快速完成长基因的基因合成和组装，包括基因组的组装；还可以快速完成需组装多个基因片段的质粒构建工作。第一步将带有目标载体同源序列的基因全长克隆到Py-2u，第二步酶切全长基因并通过Gibson重组重组到目标载体。使用本专利技术方法完成一个近10k的基因的基因合成和组装，只需要13-16天，而常规方法的耗时至少需要19-22天，时间和流程简易度上具有明显的优势。相较常规克隆流程更简便，经济高效。3、孵育过程中通过恒温孵育装置，使用不同外径尺寸的试管盛放样品，并根据试管尺寸将试管插入小试管容置罐或大试管容置罐内，大试管容置罐适用的试管的外径尺寸为20-30mm，小试管容置罐适用的试管的外径尺寸为10-20mm，方便了多个不同容量的样品的高速搅拌和离心分离，大大节省了恒温孵育的时间，提高了孵育效率。附图说明下面结合附图对本专利技术作进一步的说明。图1是本专利技术实施例2阿拉伯糖诱导后提取质粒的电泳图。图2是本专利技术实施例2最终获得的质粒酶切图谱。图3是本专利技术恒温孵育装置的三维图。图4是本专利技术容置离心机构的三维图。图5是本专利技术容置离心机构的竖向中心剖视图。图6是本专利技术减震盘的三维图。图中：100、保温外壳；200、密闭门；300、气缸伸缩杆；400、减震盘；410、转轴安装孔；420、三角减震板；430、减震柱；431、减震弹簧；432、柱安装座；440、护板；450、伺服电机；451、电机安装座；452、螺杆；460、转轴；510、多试管安装板；511、大试管卡孔；512、小试管卡孔；513、螺母；520、L形翻折板；530、大试管容置罐；540、滑轨；550、滑板；560、小试管容置罐；570、连接板。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.利用酵母组装多个基因片段到py‑2u载体的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、在需要克隆的目的基因两段添加和py‑2u载体同源的长度40‑60bp的同源序列；S2、将步骤S1得到的基因分为多个小片段，两段添加单独的酶切位点；每个小片段两端的酶切位点为同一个酶切位点，或不同的单独的酶切位点；S3、每个小片段通过基因合成或PCR扩增得到，产物平端连接到克隆载体或TA克隆到小片段载体；S4、将每个片段用所述单独的酶切位点进行酶切，回收产物后用于下一步的酵母转化。

【技术特征摘要】
1.利用酵母组装多个基因片段到py-2u载体的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、在需要克隆的目的基因两段添加和py-2u载体同源的长度40-60bp的同源序列；S2、将步骤S1得到的基因分为多个小片段，两段添加单独的酶切位点；每个小片段两端的酶切位点为同一个酶切位点，或不同的单独的酶切位点；S3、每个小片段通过基因合成或PCR扩增得到，产物平端连接到克隆载体或TA克隆到小片段载体；S4、将每个片段用所述单独的酶切位点进行酶切，回收产物后用于下一步的酵母转化。2.根据权利要求1所述的利用酵母组装多个基因片段到py-2u载体的方法，其特征在于，步骤S4酵母转化的具体步骤如下：1)挑平板上的酵母单克隆摇菌，于4mL液体YPD培养基培养过夜，次日将2mL培养基转移至50mL液体YPD培养基继续培养4-6h，至OD达到0.5-0.8；将菌液收集并离心沉淀，加0.1M醋酸锂溶液重悬用于转化；2)将DNA片段和线性化载体加入上一步骤得到的酵母菌；3)将DMSO-醋酸锂-PEG加入上一步液体，混匀，放入恒温孵育装置进行孵育处理，关闭密闭门(200)，开启伺服电机(450)，伺服电机(450)进一步带动转轴(460)、多试管安装板(510)的转动，使得样品发生高速搅拌，促进试管中样品的离心混合；4)离心后弃上清，用ddH2O重悬细胞，涂板，涂布于SC-TRP平板，30℃培养2-3天。3.根据权利要求2...

【专利技术属性】
技术研发人员：雍金贵，喻明军，苏万凯，施荣辉，王维昆，
申请(专利权)人：通用生物系统安徽有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽,34