自组装多肽新生抗原肿瘤疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种自组装多肽新生抗原肿瘤疫苗及其制备方法，自组装多肽新生抗原肿瘤疫苗，包括：将预测出的患者自身HLA有亲和力的多肽序列作为新生抗原多肽序列，标记为A段序列；将能够自组装的多肽作为自组装多肽序列，标记为B段序列；通过Spacer序列连接所述A段序列和B段序列成为完整的多肽疫苗序列，再按照完整的多肽疫苗序列制备多肽，得到自组装多肽新生抗原肿瘤疫苗；本发明专利技术引入了自组装多肽概念，通过对新生抗原多肽序列的合理设计，使得到的多肽在携带新生抗原表位的同时能够自组装形成特定的超分子结构，在体内起到佐剂效应，进一步提升肿瘤疫苗功效并减少副反应。

Self-assembled polypeptide neoantigen tumor vaccine and its preparation method

【技术实现步骤摘要】
自组装多肽新生抗原肿瘤疫苗及其制备方法
本专利技术涉及医药领域，特别是一种自组装多肽新生抗原肿瘤疫苗及其制备方法。
技术介绍
肿瘤新生抗原(neoantigens)通常由肿瘤细胞基因组突变产生，仅存在于肿瘤细胞，是肿瘤特异性抗原(tumorspecificantigen,TSA)中的一类。从2013年Rosenberg团队率先利用外显子技术在肿瘤细胞系上发现肿瘤新生抗原并验证了其能激起机体免疫反应至今，基于新生抗原的个体化肿瘤疫苗已经得到了巨大的发展。由于正常细胞不会产生和表达新生抗原，所以新生抗原能更有效的特异性地激发机体免疫反应，被认为是肿瘤免疫治疗的终极靶点。2017年《Nature》杂志发表了两篇针对新生抗原的肿瘤疫苗相关文章。美国波士顿Dana-Farber癌症中心的CatherineWu教授团队和德国美因茨大学UgurSahin团队分别使用针对肿瘤新生抗原的个体化多肽疫苗和个体化RNA疫苗治疗黑色素瘤中晚期复发高危患者。这两个实验的结果为个体化肿瘤新抗原疫苗的安全性、免疫原性、有效性提供了证据。由于开发基于新生抗原的个体化肿瘤疫苗目的是要帮助并训练患者的免疫系统特异性地识别肿瘤，从而进一步对肿瘤细胞进行杀伤并预防肿瘤细胞复发；如何高效地将抗原递呈给免疫系统在很大程度上决定了免疫系统的激活程度和反应时长，进而决定了疫苗的功效。目前全球范围内在研的新生抗原肿瘤疫苗主要包括多肽疫苗、RNA疫苗、DNA疫苗与细胞疫苗。其中，由于多肽疫苗具有易于合成与纯化，且应用安全、无潜在致癌性等优点，国内外已有多个相关临床试验正在进行。已有多个研究结表明仅仅直接采用可溶性多肽与佐剂联合给药很可能无法引起足够强烈的免疫反应。一个主要原因是这种给药方式不能将抗原和佐剂同时递送到引流淋巴结，从而导致部分经佐剂刺激的APC细胞未能接触到抗原，或部分接触到抗原的APC细胞未经过佐剂刺激；从而引起了免疫耐受及CTLFratricide。因此，如果疫苗中携带抗原的有效药物成分能够同时具有佐剂效应，将能产生更加强烈有效的免疫反应。另外，目前已经被FDA批准的广泛用于人疫苗的铝盐佐剂，对相对分子质量小的多肽抗原几乎没有佐剂活，参考(严琴英,etal.,cGAMP：一种新型疫苗佐剂.中华微生物学和免疫学杂志,2017.37(10):p.790-793)。费氏佐剂由于所含的矿物油成分不能被机体代谢，容易引起注射部位的炎症反应、肉芽肿、溃疡及发热等副反应，通常不用于人用疫苗。尽管近年来为了提高抗原的免疫原性，众多学者对新型免疫佐剂如细胞因子佐剂、免疫刺激复合物、纳米材料(如脂质体、高分子聚合物)等进行了广泛的研究。但是这些新型免疫佐剂的有效性和安全性还有待进一步的研究，需要更多的临床数据支持。以目前引起广泛关注的纳米材料——脂质体和高分子聚合物为基础的药物载体/纳米佐剂为例，尽管已有多种制备合成的方法，但是如何提高抗原负载效率、降低制备过程中的活性损失、并减小纳米材料载体在体内的代谢产物对人体的影响和副作用，仍然是需要攻克的难题。由于新生抗原多肽肿瘤疫苗均为患者个体定制，每条多肽序列和理化特性均不同，仅仅使用含有新生抗原表位的多肽进行肿瘤免疫治疗，难以保证其免疫原性。同时，因为个体化定制的新生抗原多肽的不同特性，也难以简单高效地应用一般的常见方法直接制备合成性质稳定均一的负载多肽的纳米脂质体或聚合物载体。近年来，由于易于制备、且注射后在体内代谢的产物为对人体无害的氨基酸，自组装多肽已被广泛地研究应用于药物载体、组织工程以及疫苗等生物医学领域。通过对氨基酸序列的设计，可以得到具有不同二级结构(如α-螺旋和β-折叠)的多肽，并在合适的条件下通过自组装形成特定的超分子结构。已有研究结果证明自组装多肽能在体内产生强烈的佐剂效应，参考(Rudra,J.S.,etal.,Aself-assemblingpeptideactingasanimmuneadjuvant.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,2009.107(2):p.622-627.)和(Rudra,J.S.,etal.,ModulatingAdaptiveImmuneResponsestoPeptideSelf-Assemblies.ACSNano,2012.28(6):p.1557-64.)。且自组装多肽疫苗的免疫原性是T细胞相关的，由多肽自组装形成的结构所决定，因此并不只局限于某种特定的自组装多肽序列。如果进一步在自组装多肽的氨基酸序列的N-端和/或C-端按照应用的需要增加新的氨基酸序列、脂肪链基团、或其它官能团(如巯基、马来酰亚胺基、叠氮基团等)，即可以得到具有不同特性的产物。本专利技术将自组装多肽应用到新生抗原多肽肿瘤疫苗，解决了可溶性多肽疫苗加上佐剂无法达到的肿瘤疫苗功效，及避免了使用佐剂引起的影响和副作用。
技术实现思路
为解决现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种自组装多肽新生抗原肿瘤疫苗及其制备方法，本专利技术引入了自组装多肽概念，通过对新生抗原多肽序列的合理设计，使得到的多肽在携带新生抗原表位的同时能够自组装形成特定的超分子结构，在体内起到佐剂效应，进一步提升肿瘤疫苗功效并减少副反应。为了实现上述目标，本专利技术采用如下的技术方案：自组装多肽新生抗原肿瘤疫苗，包括：将预测出的患者自身HLA有亲和力的多肽序列作为新生抗原多肽序列，标记为A段序列；将能够自组装的多肽作为自组装多肽序列，标记为B段序列；通过Spacer序列连接所述A段序列和B段序列成为完整的多肽疫苗序列，再按照完整的多肽疫苗序列制备多肽，得到自组装多肽新生抗原肿瘤疫苗；自组装多肽为可通过肽键间的氢键作用、氨基酸残基之间的氢键作用、静电作用、疏水作用以及π-π堆积作用有效实现分子自组装的多肽。前述的自组装多肽新生抗原肿瘤疫苗，新生抗原多肽序列的IC50小于50NM；IC50为利用亲和力预测算法netMHCpan分析短多肽与患者自身HLA的结合能力的预测结果。前述的自组装多肽新生抗原肿瘤疫苗，自组装多肽序列先形成β-折叠二级结构，再进一步自组装形成纳米纤维、纳米带、纳米管这几类超分子结构。前述的自组装多肽新生抗原肿瘤疫苗，自组装多肽序列包括：FF、IIIK、LLLLLK、KIIIIK、IVD、KFFE、FKFE、KEFFFFKE、KEFFFFEF、KFEFKFEF、KLVFF、KLVFFAE、QQRQQQQQEQQ、QQRFQWQFEQQ、QQKFQFQFEQQ、(AEAK)4、(AEAEAKAK)2、AEAEAEAEAKAKAKAK、FEFEFKFKFEFEFKFK、(RADA)4、RARADADARARADADA、GNNQQNY、GVFVLGFLGFLA、SIINFEKL。前述的自组装多肽新生抗原肿瘤疫苗，Spacer序列与A段序列和B段序列之间的连接方式包括：AX-S-B，AX-S-B-S-AY，AX-S-B-S-AY-S-B-S-AZ。自组装多肽新生抗原肿瘤疫苗的制备方法，包括如下步骤：步骤一，个体化肿瘤新生抗原多肽序列的筛选与设计；分别将肿瘤患者的正常细胞DNA测序结果和肿瘤细胞DNA测序结果比对到人类参考基因组(Ensemblhg38)，从比对结果中鉴定本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.自组装多肽新生抗原肿瘤疫苗，其特征在于，包括：将预测出的患者自身HLA有亲和力的多肽序列作为新生抗原多肽序列，标记为A段序列；将能够自组装的多肽作为自组装多肽序列，标记为B段序列；通过Spacer序列连接所述A段序列和B段序列成为完整的多肽疫苗序列，再按照完整的多肽疫苗序列制备多肽，得到自组装多肽新生抗原肿瘤疫苗；所述自组装多肽为可通过肽键间的氢键作用、氨基酸残基之间的氢键作用、静电作用、疏水作用以及π‑π堆积作用有效实现分子自组装的多肽。

【技术特征摘要】
1.自组装多肽新生抗原肿瘤疫苗，其特征在于，包括：将预测出的患者自身HLA有亲和力的多肽序列作为新生抗原多肽序列，标记为A段序列；将能够自组装的多肽作为自组装多肽序列，标记为B段序列；通过Spacer序列连接所述A段序列和B段序列成为完整的多肽疫苗序列，再按照完整的多肽疫苗序列制备多肽，得到自组装多肽新生抗原肿瘤疫苗；所述自组装多肽为可通过肽键间的氢键作用、氨基酸残基之间的氢键作用、静电作用、疏水作用以及π-π堆积作用有效实现分子自组装的多肽。2.根据权利要求1所述的自组装多肽新生抗原肿瘤疫苗，其特征在于，所述新生抗原多肽序列的IC50小于50NM；所述IC50为利用亲和力预测算法netMHCpan分析短多肽与患者自身HLA的结合能力的预测结果。3.根据权利要求1所述的自组装多肽新生抗原肿瘤疫苗，其特征在于，所述自组装多肽序列先形成β-折叠二级结构，再进一步自组装形成纳米纤维、纳米带、纳米管这几类超分子结构。4.根据权利要求3所述的自组装多肽新生抗原肿瘤疫苗，其特征在于，所述自组装多肽序列包括：FF、IIIK、LLLLLK、KIIIIK、IVD、KFFE、FKFE、KEFFFFKE、KEFFFFEF、KFEFKFEF、KLVFF、KLVFFAE、QQRQQQQQEQQ、QQRFQWQFEQQ、QQKFQFQFEQQ、(AEAK)4、(AEAEAKAK)2、AEAEAEAEAKAKAKAK、FEFEFKFKFEFEFKFK、(RADA)4、RARADADARARADADA、GNNQQNY、GVFVLGFLGFLA、SIINFEKL。5.根据权利要求1所述的自组装多肽新生抗原肿瘤疫苗，其特征在于，所述Spacer序列与A段序列和B段序列之间的连接方式包括：AX-S-B，AX-S-B-S-AY，AX-S-B-S-AY-S-B-S-AZ。6.自组装多肽新生抗原肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一，个体化肿瘤新生抗原多肽序列的筛选与设计；分别将肿瘤患者的正常细胞DNA测序结果和肿瘤细胞DNA测序结果比对到人类参考基因组(Ensemblhg38)，从比对结果中鉴定出肿瘤细胞特有的体细胞突变；根据这些突变信息预测可能存在于肿瘤细胞中的新生抗原，同时，从比对结果中预测患者自身的I类HLA分型；根据I类HLA能够结合的多肽长度8-11个氨基酸，截取含有突变氨基酸的多肽序列，利用亲和力预测算法netMHCpan分析短多肽与患者自身HLA的结合能力；根据与HLA的亲和力、突变的可信程度、突变频率筛选出...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩宁，莫凡，陈荣昌，
申请(专利权)人：杭州纽安津生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33