细菌化肿瘤细胞疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术公布了一种细菌化肿瘤细胞疫苗及其制备方法。将对数生长期细菌裂解获得细菌裂解物；将过量的含有氨基的化合物溶液和细菌裂解物溶液混匀，在1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)的作用下，细菌蛋白上的羧基与乙二胺的一个氨基形成酰胺键，从而将细菌蛋白的羧基转化成带正电荷的氨基，此过程称为氨基化。将带正电荷的氨基化细菌裂解物与肿瘤细胞混合放置一段时间后，氨基化细菌裂解物中的蛋白质结合到细胞表面，成为细菌化肿瘤细胞，再将细菌化肿瘤细胞灭活后制成细菌化肿瘤细胞疫苗。在小鼠肿瘤模型中证实这种疫苗有很好的治疗肿瘤效果，具有良好的转化应用前景。

Bacterial Tumor Cell Vaccine and Its Preparation Method

【技术实现步骤摘要】
细菌化肿瘤细胞疫苗及其制备方法
本专利技术涉及肿瘤细胞疫苗及疫苗制备技术，尤其涉及一种利用肿瘤细胞制备具有潜在治疗肿瘤作用的新型疫苗及其制备方法。
技术介绍
免疫识别的关键环节是免疫系统要对危险信号进行识别，对于入侵的病原生物，危险信号就是病原相关分子模式(Pathogen-associatedmolecularpatterns，PAMPs)，而自身异常的细胞则是损伤相关分子模式(Damage-associatedmolecularpatterns，DAMPs)。当前应用的有效疫苗几乎都针对细菌、病毒等病原微生物，其中最重要的原因是细菌和病毒能供给免疫系统有效的PAMPs信号。肿瘤免疫方法多种多样，总体可归纳为被动(passive)和主动(active)免疫两大类，前者包括肿瘤特异抗体、细胞因子和过继免疫活性细胞等；后者包括肿瘤特异或相关抗原的蛋白或多肽疫苗、树突状细胞(DC)疫苗、同种或异种肿瘤全细胞疫苗、Checkpointblocker等。肿瘤全细胞疫苗是肿瘤免疫技术中的一个重要领域。由于肿瘤细胞是自身细胞，免疫原性较差，免疫系统对自身的肿瘤细胞也处于免疫耐受状态，直接选用经过处理(如辐射)使其不再具备增殖能力的肿瘤细胞作为疫苗效果并不理想。因此，制备肿瘤全细胞疫苗的关键是如何让免疫系统识别自身细胞抗原，进而打破免疫耐受。1993年，英国学者Dranoff等将粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)转入黑色素瘤细胞表达并进行辐射处理后用作全细胞疫苗，在小鼠黑色素瘤模型中发现能够诱导树突状细胞(DCs)迁移、分化和成熟，这种DCs能在肿瘤原位处理肿瘤抗原，因而诱导肿瘤特异的免疫反应。此后，采用各种各样的修饰手段便成为肿瘤全细胞疫苗打破免疫耐受的主要技术策略。四川大学学者针对肿瘤组织免疫抑制的微环境，在肿瘤细胞中表达基质纤维母细胞的成纤维细胞激活蛋白，在小鼠肿瘤模型中证明可以有效诱导抗肿瘤免疫反应；美国科学家在肾癌细胞中表达能够让先天免疫系统和DCs相互作用的NY-ESO-1分子，在小鼠模型中发现能促使DCs强有力处理并递呈肿瘤抗原，诱导有效的肿瘤特异免疫反应；爱尔兰研究者采用肿瘤特异光热处理，让肿瘤组织原位释放肿瘤抗原，然后用一种纳米材料加速抗原递呈细胞来处理肿瘤抗原，发现可以有效诱导肿瘤特异的细胞免疫反应；中科院学者利用纳米生物材料将多种(GM-CSF和IL-2)免疫增强成分转入肿瘤细胞，这种肿瘤全细胞疫苗较单成分疫苗具有更好的抗肿瘤效果。目前，尽管有多种肿瘤全细胞疫苗在临床进行试验，但进入III期后都表现不理想，因此，肿瘤全细胞疫苗仍然需要技术改进，才有可能真正转化应用于临床。
技术实现思路
本专利技术的目的在于：提供细菌化肿瘤细胞疫苗以及制备方法，该新型疫苗的主要特征为在肿瘤细胞表面覆盖一层细菌抗原成分；本专利技术将这种在肿瘤细胞表面覆盖细菌抗原成分的过程称为细菌化；将细菌化的肿瘤细胞灭活后制备成为肿瘤特异疫苗。将本专利技术的细菌化肿瘤细胞作为疫苗接种于肿瘤模型小鼠皮下(也可血管、肌肉或腹腔内注射等)，可以诱导肿瘤细胞产生特异的免疫反应，具有很好的治疗肿瘤作用，展示了良好的转化应用前景。本专利技术将典型病原细菌裂解物(主要成分为蛋白质，作为抗原)粘附覆盖于肿瘤细胞表面(本专利技术将这一过程称为“肿瘤细胞细菌化”或“细菌化肿瘤细胞”，图1为肿瘤细胞细菌化的主要原理和步骤)，也就是通过细菌化肿瘤细胞人为地给肿瘤细胞增加细菌的PAMPs信号。如图1所示，将细菌裂解物和过量带有正电荷的氨基化合物(如乙二胺)混合，氨基化合物中的氨基(-NH2)在酸性环境中经质子化后成为带正电荷的氨基(-NH3+)，然后在1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)的作用下，使得带有正电荷的氨基(-NH3+)结合到细菌裂解物的蛋白质上，从而使细菌裂解物带有正电荷，即：在EDC的作用下，细菌蛋白上的羧基与乙二胺的一个氨基形成酰胺键，从而将细菌蛋白的羧基转化成带正电荷的氨基(显正电性，此过程称为氨基化)，氨基化的蛋白质在生理溶液中带正电荷。此后加进细胞表面带有阴性电荷的肿瘤细胞，使二者通过正负电荷机制结合在一起，成为本专利技术提供的细菌化肿瘤细胞，灭活后将此细胞作为肿瘤疫苗。用这种细菌化肿瘤细胞作为疫苗，在小鼠肿瘤模型中进行实验，发现注射这种细菌化肿瘤细胞疫苗后能有效诱导肿瘤细胞特异的免疫反应，具有很好的治疗肿瘤作用。本专利技术通过“细菌化肿瘤细胞”来制备肿瘤疫苗，这是一种新的制备肿瘤细胞疫苗的策略方法，具有临床转化应用的前景。为了实现上述目标，本专利技术的技术方案为：一种细菌化肿瘤细胞疫苗及其制备方法，其特征包括以下方法、步骤和性能：1)氨基化细菌裂解物。先按照实验室常规方法培养细菌，收集细菌体并经冻溶和超声波裂解，将细菌裂解液冻干成粉状，即成为本专利技术需要的细菌裂解物。制备得到的细菌裂解物用于下一步制备氨基化细菌裂解物。本专利技术具体实施时，培养的细菌为大肠杆菌，也可以是其他细菌(如结核杆菌、葡萄球菌、假单胞菌、克雷白杆菌等)。然后在酸性环境下将过量的氨基化合物溶液(带有正电荷-NH3+)和细菌裂解物混匀，接着加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)后连续搅拌一段时间(具体实施时优选为48～52小时)，在此期间每间隔一段时间(如16小时)加进新的DEC溶液。此后，在超纯水中透析掉没有和细菌裂解物中的蛋白质结合的氨基化合物和未反应的EDC等成分，就获得本专利技术需要的氨基化细菌裂解物溶液。上述氨基化过程中，氨基化合物提供氨基给细菌裂解物，因此反应过程中须保证任何时间氨基化合物都要有足够的浓度，故反应过程中需反复添加。氨基化合物包括但不限于乙二胺；氨基化过程除了使用乙二胺外，也可以使用含有氨基基团的其他化学物质(如N,N-二甲基乙二胺、聚乙烯亚胺)，因此，使用任何其他氨基物质氨基化细菌裂解物都可以的，均属于本专利技术权利范围。2)用氨基化细菌裂解物制备细菌化肿瘤细胞。按实验室培养肿瘤细胞的常规方法体外培养相应的肿瘤细胞，达到需要的细胞数量后收集对数生长期的细胞，计数后用磷酸盐缓冲溶液(PBS溶液)调整肿瘤细胞浓度(调整至肿瘤细胞数量为1×106个细胞/100μL)；然后按比例将肿瘤细胞液(50μL)和氨基化细菌裂解物溶液(50μL，含蛋白质0.1mg)混匀，室温下轻摇(如30～50分钟)后即成为细菌化肿瘤细胞。3)灭活细菌化肿瘤细胞制成细菌化肿瘤细胞疫苗。将制备得到的细菌化肿瘤细胞放置于X线辐照仪(具体实施时采用RadSourceRS2000)中，按一定的辐射强度(如80～100Gy)对细菌化肿瘤细胞进行灭活，使细菌化肿瘤细胞当作疫苗注射后不再继续生长增殖和转移，从而达到安全的目的。然后将灭活的细菌化肿瘤细胞作为疫苗给小鼠注射，每只小鼠注射5×101～10个细菌化肿瘤细胞。具体实施时，可按每只小鼠用3～5×105个细菌化肿瘤细胞，在小鼠皮下、血管、腹腔内等途径注射。较佳地，步骤1)具体为：按实验室常规通用方法培养细菌，收集对数生长期的细菌菌体，先后置于-160℃液氮(半小时以上)和37℃水浴(至全部溶解)反复冻融三次，然后用超声波对冻溶后的细菌进行破碎，离心(4℃，10000rpm)10分钟后取上清即为细菌裂解物，此后将细菌裂解物即刻本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种细菌化肿瘤细胞疫苗的制备方法，其特征是，所述细菌化指在肿瘤细胞表面覆盖一层细菌或细菌抗原成分的过程；制备所述细菌化肿瘤细胞疫苗包括以下步骤：1)氨基化细菌裂解物：在酸性环境下将过量氨基化合物与细菌裂解物混合，使得氨基化合物中带有正电荷的氨基结合到细菌裂解物的蛋白质上，细菌蛋白上的羧基与氨基形成酰胺键，从而将细菌蛋白的羧基转化成带正电荷的氨基，由此使得细菌裂解物带有正电荷；2)用氨基化细菌裂解物细菌化肿瘤细胞：将要制备疫苗的肿瘤细胞与步骤1)得到的氨基化细菌裂解物混合并轻摇，使得带有正电荷的细菌裂解物与表面带有负电荷的肿瘤细胞通过正负电荷机制结合在一起，即得到细菌化肿瘤细胞；3)灭活步骤2)得到的细菌化肿瘤细胞，即制成安全的细菌化肿瘤细胞疫苗。

【技术特征摘要】
1.一种细菌化肿瘤细胞疫苗的制备方法，其特征是，所述细菌化指在肿瘤细胞表面覆盖一层细菌或细菌抗原成分的过程；制备所述细菌化肿瘤细胞疫苗包括以下步骤：1)氨基化细菌裂解物：在酸性环境下将过量氨基化合物与细菌裂解物混合，使得氨基化合物中带有正电荷的氨基结合到细菌裂解物的蛋白质上，细菌蛋白上的羧基与氨基形成酰胺键，从而将细菌蛋白的羧基转化成带正电荷的氨基，由此使得细菌裂解物带有正电荷；2)用氨基化细菌裂解物细菌化肿瘤细胞：将要制备疫苗的肿瘤细胞与步骤1)得到的氨基化细菌裂解物混合并轻摇，使得带有正电荷的细菌裂解物与表面带有负电荷的肿瘤细胞通过正负电荷机制结合在一起，即得到细菌化肿瘤细胞；3)灭活步骤2)得到的细菌化肿瘤细胞，即制成安全的细菌化肿瘤细胞疫苗。2.如权利要求1所述细菌化肿瘤细胞疫苗的制备方法，其特征是，步骤1)氨基化细菌裂解物包括如下步骤：11)培养细菌，收集细菌体并经冻溶和超声波裂解，细菌裂解上清即为细菌裂解物；进一步可将细菌裂解液冻干成粉状，得到细菌裂解物冻干粉；12)将过量氨基化合物和步骤11)得到的细菌裂解物混合；氨基化合物包括但不限于乙二胺、N,N-二甲基乙二胺、聚乙烯亚胺；13)加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)，并在低温环境中搅拌；每间隔一定时间加进新的EDC，连续一段时间后即制得氨基化细菌裂解物；14)在超纯水中透析掉没有和细菌裂解物中的蛋白质结合的氨基化合物和EDC成分，即获得氨基化细菌裂解物溶液；15)再将透析获得的氨基化细菌裂解物溶液调至PH值为7～9。3.如权利要求2所述细菌化肿瘤细胞疫苗的制备方法，其特征是，优选地，所述氨基化合物采用乙二胺；具体将乙二胺、超纯水、细菌裂解物进行混合后，加入EDC并在4℃环境中搅拌；过程中不断加进新的EDC，连续48～52小时。4.如权利要求1所述细菌化肿瘤细胞疫苗的制备方法，其特征是，优选地，步骤1)制备细菌裂解物具体包括如下步骤：培养细菌，收集对数生长期的细菌菌体；将收集到的细菌菌体先后置于-160℃液氮中半小时以上和37℃水浴中至全部溶解，反复冻融三次；然后用超声波对冻溶后的细菌进行破碎，在4℃和10000rpm进行离心10～12分钟，取上清即为细菌裂解物；此后可...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭光宏，黄风迎，张立明，吕卓璇，林映莹，
申请(专利权)人：海南医学院，
类型：发明
国别省市：海南,46