一种细胞膜肿瘤疫苗及制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种细胞膜肿瘤疫苗及制备方法和应用。本发明专利技术首次不使用外源肿瘤抗原和过继细胞，利用细胞融合技术使树突状细胞和肿瘤细胞发生融合，培养后使得全肿瘤抗原和共刺激分子在融合细胞的细胞膜上表达。剥离融合细胞的细胞膜包裹在纳米粒子上制备的纳米细胞膜疫苗能像抗原呈递细胞一样直接激活T细胞，也可以被树突状细胞识别，加工并呈递给T细胞，间接激活T细胞。结合这两种T细胞激活通路，能够引起强烈的抗肿瘤免疫响应。本发明专利技术的模拟肿瘤细胞和抗原呈递细胞的细胞膜肿瘤疫苗策略能够开发针对多种肿瘤类型的疫苗，并且具有良好的生物相容性和系统安全性。因此，这种细胞膜疫苗非常适合于肿瘤疫苗领域。

【技术实现步骤摘要】
一种细胞膜肿瘤疫苗及制备方法与应用
本专利技术属于生物肿瘤疫苗领域，涉及一种细胞膜肿瘤疫苗及制备方法与应用。
技术介绍
近年来，许多学者进行了肿瘤疫苗的研究。通过注射疫苗，训练自身免疫系统来监测和消除系统肿瘤，并达到记忆效果，能够长期监测和预防肿瘤的发生。但是，肿瘤细胞会发生抗原或其他变化，使其能够逃脱免疫系统的消除，比如肿瘤细胞激活下调某些类型的肿瘤抗原来逃避免疫响应。所以，肿瘤疫苗包含尽可能多的肿瘤抗原，就可以避免因为肿瘤细胞下调某些肿瘤抗原的表达而引发的免疫逃逸。但是，迄今为止已知的肿瘤抗原的数量是非常有限的。另外，结合多种肿瘤抗原到一个纳米体系中是很难实现的，因为制备过程太昂贵并且复杂。所以，科研工作者一方面致力于肿瘤抗原的筛选鉴定，另一方面使用包含多种肿瘤抗原的肿瘤产物，如肿瘤裂解物。上述手段存在的主要缺点：(1)肿瘤抗原的筛选鉴定，复杂成本高，耗时较长，不能满足目前对肿瘤疫苗的急需情况；(2)肿瘤裂解物等包含肿瘤遗传物质，有潜在的致癌风险；(3)回输的免疫细胞保存困难。因此，有必要设计一种新的肿瘤疫苗系统，以克服上述问题。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的目的在本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种细胞膜肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：(1)将肿瘤细胞灭活处理，得到灭活的肿瘤细胞；(2)将灭活的肿瘤细胞和树突状细胞进行融合，得到融合细胞；(3)将融合细胞的细胞膜剥离，得到纯化的融合细胞膜，即为细胞膜肿瘤疫苗。

【技术特征摘要】
1.一种细胞膜肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：(1)将肿瘤细胞灭活处理，得到灭活的肿瘤细胞；(2)将灭活的肿瘤细胞和树突状细胞进行融合，得到融合细胞；(3)将融合细胞的细胞膜剥离，得到纯化的融合细胞膜，即为细胞膜肿瘤疫苗。2.根据权利要求1所述的细胞膜肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)将肿瘤细胞从培养皿上消化下来，离心收集，用磷酸缓冲液(PBS，pH＝7.4)洗三次；肿瘤细胞用20％的乙醇溶液在4℃处理10-30min以灭活肿瘤细胞，以500g转速离心5-15分钟后，收集细胞；用PBS重新分散细胞，500g转速离心5-15分钟，重复上述PBS分散和离心三次；所述步骤(2)将分散在PBS中的树突状细胞和分散在PBS的上述灭活的肿瘤细胞以10:1至2:1的不同比例进行均匀混合，以500g的转速离心5-15分钟后，尽可能地吸弃上层清液；在30-120秒内，逐滴加入0.5-2毫升预先加温到37-40℃的含有50％聚乙二醇(分子量为2000-4000)和0-10％二甲亚砜的无血清培养基中；37-40℃孵育1-5分钟，缓慢加入无血清培养基，至10-50毫升，终止融合过程；以500g的转速离心5-15分钟，分离细胞，细胞再分散在含有10％胎牛血清，1％双抗(青霉素-链霉素，10000单位/毫升)和白介素-4(10纳克/毫升)的培养基中；融合细胞在湿润的包含5％二氧化碳的37℃的培养箱中培养，每隔一天用含有10％胎牛血清，1％双抗(青霉素-链霉素，10000单位/毫升)和白介素-4(10纳克/毫升)的培养基进行半数换液，连续培养4-10天；所述培养基为适合融合细胞生长的培养基；所述步骤(3)将融合细胞用细胞刮刀刮下来收集；收集的细胞用冷PBS再分散，500g离心5-15分钟收集细胞，重复PBS分散和离心过程两次；收集细胞分散到包含0.1％苯甲基磺酰氯的细胞裂解液中，并在冰水浴中孵育10-30分钟；接着通过反复冻融三次使细胞破裂；在4℃以700g转速离心8-15分钟以除掉细胞核；吸取上层液体，在4℃条件下以14000g转速离心20-50分钟得到纯化的细胞膜碎片；细胞膜碎片冻干称重，-80℃冰箱中保存，冻干的细胞膜材料在使用前用超纯水水化。3.根据权利要求2所述的细胞膜肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)将肿瘤细胞从培养皿上消化下来，离心收集，用PBS洗三次，肿瘤细胞用20％的乙醇溶液在4℃处理15min以灭活肿瘤细胞，以500g转速离心10分钟后，收集细胞；用PBS重新分散细胞，500g转速离心10分钟，重复上述PBS分散和离心三次；所述步骤(2)将分散在PBS中的树突状细胞和分散在PBS的上述灭活的肿瘤细胞以2:1的比例进行均匀混合，以500g的转速离心10分钟后，尽可能地吸弃上层清液；在60秒内，逐滴加入1毫升预先加温到38℃的含有50％聚乙二醇(分子量为4000)和10％二甲亚砜的无血清培养基中；38℃孵育1分钟，缓慢加入无血清培养基，到50毫升，终止融合过程，以500g的转速离心15分钟，分离细胞，细胞再分散在含有10％胎牛血清，1％双抗(青霉素-链霉素，10000单位/毫升)和白介素-4(10纳克/毫升)的培养基中；融合细胞在湿润的包含5％二氧化碳的37℃的培养箱中培养，每隔一天用含有10％胎牛血清，1％双抗(青霉素-链霉素，10000单位/毫升)和白介素-4(10纳克/毫升)的培养基进行换液，连续培养6天；所述培养基为适合融合细胞生长的培养基；所述步骤(3)将融合细胞用细胞刮刀刮下来收集；收集的细胞用冷PBS再分散，500g离心10分钟收集细胞，重复PBS分散和离心过程两次，收集细胞分散到包含0.1％苯甲基磺酰氯的细胞裂解液中，并在冰水浴中孵育15分钟，接着通过反复冻融三次使细胞破裂，在4℃以700g转速离心10分钟以除掉细胞核；吸取上层液体，在4℃条件下以14000g转速离心30分钟得到纯化的细胞膜碎片，细胞膜碎片冻干称重，-80℃冰箱中保存，冻干的细胞膜材料在使用前用超纯水水化。4.根据权利要求1所述的细胞膜肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)细胞融合方法为病毒诱导融合，电融合法和聚乙二醇诱导融合中的任意一种；所述的病毒融合法：将肿瘤细胞和树突状细胞按照10:1-2:1的比例均匀混合，加入灭活的仙台病毒，4℃条下共培养1-5分钟，使病毒附着在细胞膜上，并使细胞相...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯俊，张先正，刘文龙，邹梅珍，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42