基于胞外诱捕网原理制成的肿瘤细胞疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术公布了一种基于胞外诱捕网原理制成的新型肿瘤细胞疫苗及其制备方法，在肿瘤细胞表面形成胞外诱捕网(Extracellular traps)结构的CpG寡聚脱氧核苷酸网，肿瘤细胞胞外诱捕网的主要成分为CpG寡聚脱氧核苷酸和组蛋白，使得肿瘤细胞成为胞外诱捕网化肿瘤细胞，经灭活即制成安全的肿瘤细胞疫苗。将本发明专利技术提供的肿瘤细胞疫苗接种于肿瘤模型小鼠，可以诱导肿瘤细胞产生有效的免疫反应，达到有效治疗肿瘤的作用，具有良好的临床转化前景。在实际应用中，可针对特定的肿瘤细胞制备成特异的胞外诱捕网化肿瘤细胞疫苗。本发明专利技术为转化应用于人类肿瘤的治疗应用提供了可行性及技术支持。

Cancer cell vaccine based on the principle of extracellular trap net and its preparation method

【技术实现步骤摘要】
基于胞外诱捕网原理制成的肿瘤细胞疫苗及其制备方法
本专利技术涉及肿瘤疫苗及其制备技术，尤其涉及一种基于细胞诱捕网原理制成的新型肿瘤细胞疫苗及其制备方法。该肿瘤疫苗的主要特征为在肿瘤细胞表面包被细胞诱捕网的主要成分CpG寡聚脱氧核苷酸(CpGODN，一种DNA)和组蛋白，将这种肿瘤细胞灭活后制备成为具有治疗肿瘤作用的新型疫苗。
技术介绍
肿瘤全细胞疫苗是一种新的肿瘤疫苗模式。但是，由于肿瘤细胞是自身细胞，免疫系统对自身的肿瘤细胞未能引起有效的免疫反应，因此不能直接利用自身肿瘤细胞制备成疫苗。国内外已经有学者将肿瘤细胞进行改造或修饰，利用基因重组技术将可以增强免疫细胞活性和功能的细胞因子(比如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、成纤维细胞激活蛋白、白细胞介素-2等一种或多种复合)转入肿瘤细胞来增强免疫反应。尽管已经有肿瘤细胞疫苗进入临床试验，但效果并不理想，仍然需要专利技术更好的技术或策略来制备新的肿瘤细胞疫苗。胞外诱捕网(ExtracellularTraps)的概念起源于中性粒细胞诱捕网(Neutrophilextracellulartraps)。这种现象最早在中性粒细胞中发现，近来由于在单核细胞、巨噬细胞、嗜酸(碱)性粒细胞、NK细胞等免疫细胞中均有发现，并不只限于中性粒细胞，因此用“胞外诱捕网”来统称这一种现象。所谓胞外诱捕网，指的是处于死亡前状态的免疫细胞(上述提到的细胞种类)释放的一种纤维网状结构，主要成分为细胞核内物质，包括浓缩的DNA、组蛋白、颗粒蛋白等。这种网状结构能够将病原微生物甚至某些自身病变细胞包裹住，促使免疫细胞吞噬清除所包裹的病原微生物和/或细胞，在吞噬清除过程中也处理和递呈相应的抗原，进而激活和提高所吞噬微生物和/或细胞的特异性免疫反应。近来研究还发现，自身免疫性疾病病人标志性抗核抗体的产生和胞外诱捕网相关。但是，目前尚未出现利用胞外诱捕网机理或成分有效制备肿瘤细胞疫苗的技术方案。
技术实现思路
本专利技术的目的在于：提供一种基于胞外诱捕网原理制成的新型肿瘤细胞疫苗及其制备方法，该新型疫苗利用细胞诱捕网的主要成分DNA(本专利技术选用具有免疫佐剂功能的CpGODN)和组蛋白，将它们包被于肿瘤细胞的表面，使肿瘤细胞表面形成一个胞外诱捕网(Extracellulartraps)类似结构；本专利技术将CpGODN和组蛋白包被于肿瘤细胞表面后，将这种肿瘤细胞称为“胞外诱捕网化肿瘤细胞。具体实施表明，将本专利技术的胞外诱捕网化肿瘤细胞作为疫苗接种于肿瘤模型小鼠皮下(也可通过血管、肌肉和腹腔内注射等途径注射)，可以诱导肿瘤细胞产生有效的免疫反应，达到有效治疗肿瘤的作用，具有良好的临床转化前景。本专利技术的原理：目前研究发现，自身免疫性疾病病人标志性抗核抗体的产生和胞外诱捕网相关，说明胞外诱捕网可以诱导免疫系统产生针对所包裹细胞的特异性免疫反应。Toll样受体(TLRs)是先天和后天免疫的桥梁。CpG寡聚脱氧核苷酸(CpGODN)是一种特殊的DNA和疫苗佐剂，也是Toll样受体9(TLR9)的配体，在病原体感染阶段，它能被树突状细胞(DCs)等抗原呈递细胞上的TLR9识别，促进DCs的成熟；成熟的DCs通过分泌INF-α等细胞因子促进CD8+T细胞、NK和Th1细胞的免疫反应。因此，CpGODN作为免疫佐剂已经应用于临床和多种开发中的疫苗。肿瘤表面表达某些免疫检查点分子(比如PD-L1、CD47)，它们能被免疫细胞上的分子(比如PD-1和SIRPα)识别并促使免疫细胞对肿瘤细胞失去反应。本专利技术基于胞外诱捕网的原理，利用肿瘤细胞表面和CpGODN均带有负电荷的特性，提出一种将DNA(CpGODN)和组蛋白包被于肿瘤细胞表面，在肿瘤细胞表面形成一个胞外诱捕网结构的CpGODN网，制备成胞外诱捕网化肿瘤细胞，再将这种胞外诱捕网化肿瘤细胞灭活后即可制备成为具有治疗肿瘤作用的新型疫苗。上述疫苗由CpGODN、组蛋白和肿瘤细胞三种成分组成。通过这种设计，免疫细胞就有可能通过以下两种途径诱导产生肿瘤细胞特异的免疫反应：(1)肿瘤细胞表面的CpGODN是一种危险信号，可以通过TLR9信号通路诱导特异的免疫反应；(2)包被肿瘤细胞的CpGODN网有可能覆盖住细胞表面的PD-L1、CD47等检查点分子，从而阻断PD-1/PD-L1和CD47/SIRPα的信号通路，也可促进免疫反应。将这种胞外诱捕网化肿瘤细胞灭活后作为肿瘤疫苗注射肿瘤模型小鼠，能诱导免疫系统产生肿瘤细胞特异的免疫反应，具有很好的治疗肿瘤作用。本专利技术通过“胞外诱捕网化肿瘤细胞”来制备肿瘤疫苗，这是一种新的制备肿瘤疫苗的技术方法，具有临床转化应用的前景。本专利技术提供的技术方案是：一种基于胞外诱捕网制备的新型肿瘤细胞疫苗，疫苗的成分包括DNA(如CpG寡聚脱氧核苷酸(CpGODN))、组蛋白和肿瘤细胞；其中的DNA和组蛋白是构成细胞诱捕网的主要成分；具体实施时，DNA选用CpGODN；CpGODN和组蛋白包被于肿瘤细胞表面，成为胞外诱捕网化肿瘤细胞；具体地，肿瘤细胞膜骨架和CpGODN主要成分均有磷酸，肿瘤细胞表面和CpGODN均带有负电荷；组蛋白含大量碱性的精氨酸和赖氨酸而带有正电荷；通过组蛋白的桥梁作用，带负电荷的CpGODN联结到同样带负电荷的肿瘤细胞表面，由此成为本专利技术提供的胞外诱捕网化肿瘤细胞；其中的肿瘤细胞可以从肿瘤患者手术后(离体)的肿瘤组织进行分离提取，从而制成肿瘤患者个体化的肿瘤细胞疫苗。本专利技术将细胞诱捕网的主要成分DNA(CpGODN)和组蛋白包被于肿瘤细胞表面，图1为制备胞外诱捕网化肿瘤细胞的主要原理和方法步骤。如图1所示，肿瘤细胞表面和CpGODN都带有负电荷；组蛋白则带有正电荷。通过组蛋白的桥梁作用，将带负电荷的CpGODN联结到同样带负电荷的肿瘤细胞表面，即成为本专利技术提供的胞外诱捕网化肿瘤细胞。本专利技术提供了上述基于胞外诱捕网原理制成的新型肿瘤细胞疫苗及其制备方法，包括以下步骤：1)培养肿瘤细胞，达到需要的细胞数量后收集对数生长期的细胞，计数后用磷酸盐缓冲溶液(PBS溶液)将肿瘤细胞数量调整至1×106个细胞/100μL。也可以用生理盐水等和人体体液渗透压相同或相近的溶液替换PBS溶液。2)用PBS将CpGODN与组蛋白按质量比1：0.5～10混匀，然后加入肿瘤细胞(按CpGODN1μg加入103～104个肿瘤细胞的比例)，在室温下摇动10～20分钟。3)离心去除上清，即得到胞外诱捕网化肿瘤细胞；可用PBS溶液清洗沉淀的胞外诱捕网化肿瘤细胞二次后，再次用PBS溶液将胞外诱捕网化肿瘤细胞数量调整至适当浓度(如1×106个细胞/100μL)，调整的浓度大小可视注射疫苗所需要的浓度而定。4)将制备得到的胞外诱捕网化肿瘤细胞放置于X线辐照仪(具体实施时采用RadSourceRS2000)中，按辐射强度50～100Gy对胞外诱捕网化肿瘤细胞进行灭活，使胞外诱捕网化肿瘤细胞当作疫苗注射后不再继续生长、增殖和转移，从而达到安全的目的。具体实施时，将灭活的胞外诱捕网化肿瘤细胞作为疫苗给小鼠注射，每只小鼠每次注射3～5×105个胞外诱捕网化肿瘤细胞(注射时调整到需要的浓度，最好将胞外诱捕网化肿瘤细胞溶于80～100μLPBS中)，注射途径可为皮下、肌肉、血管、腹腔内等等本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种新型肿瘤细胞疫苗，其特征是：所述肿瘤细胞疫苗的成分包括DNA、组蛋白和肿瘤细胞；所述DNA为CpG寡聚脱氧核苷酸；所述肿瘤细胞可从任何肿瘤组织进行分离提取；所述CpG寡聚脱氧核苷酸和组蛋白包被于肿瘤细胞表面，在肿瘤细胞表面形成类似胞外诱捕网结构的CpG寡聚脱氧核苷酸网，主要成分为CpG寡聚脱氧核苷酸和组蛋白，由此使得肿瘤细胞成为胞外诱捕网化肿瘤细胞；胞外诱捕网化肿瘤细胞经灭活即为安全的肿瘤细胞疫苗。

【技术特征摘要】
1.一种新型肿瘤细胞疫苗，其特征是：所述肿瘤细胞疫苗的成分包括DNA、组蛋白和肿瘤细胞；所述DNA为CpG寡聚脱氧核苷酸；所述肿瘤细胞可从任何肿瘤组织进行分离提取；所述CpG寡聚脱氧核苷酸和组蛋白包被于肿瘤细胞表面，在肿瘤细胞表面形成类似胞外诱捕网结构的CpG寡聚脱氧核苷酸网，主要成分为CpG寡聚脱氧核苷酸和组蛋白，由此使得肿瘤细胞成为胞外诱捕网化肿瘤细胞；胞外诱捕网化肿瘤细胞经灭活即为安全的肿瘤细胞疫苗。2.如权利要求1所述肿瘤细胞疫苗，其特征是，所述肿瘤细胞的细胞膜骨架和CpG寡聚脱氧核苷酸均含有磷酸，肿瘤细胞表面和CpG寡聚脱氧核苷酸均带有负电荷；组蛋白含碱性的精氨酸和赖氨酸，组蛋白带有正电荷；CpG寡聚脱氧核苷酸通过组蛋白联结到肿瘤细胞表面，由此使得CpG寡聚脱氧核苷酸和组蛋白包被于肿瘤细胞表面，成为胞外诱捕网化肿瘤细胞。3.如权利要求1所述肿瘤细胞疫苗，其特征是，所述肿瘤细胞为结肠癌CT26细胞；将所述肿瘤细胞疫苗中肿瘤细胞数量进行调整后给小鼠注射。4.一种基于胞外诱捕网制备肿瘤细胞疫苗的方法，其特征是，在肿瘤细胞表面形成胞外诱捕网结构的CpG寡聚脱氧核苷酸网，使得肿瘤细胞成为胞外诱捕网化肿瘤细胞，经灭活即制成安全的肿瘤细胞疫苗；包括如下步骤：1)培养肿瘤细胞，收集对数生长期的细胞并计数；然后用生理盐水或磷酸盐缓冲溶液调整肿瘤细胞的数量浓度；2)用生理盐水或磷酸盐缓冲溶液将CpG寡聚脱氧核苷酸与组蛋白按质量比1：0.5～10混匀，然后按1μg的CpG寡聚脱氧核苷酸与103～104个肿瘤细胞的比例加入肿瘤细胞，在室温下轻摇得到的混合液；3)将步骤2)得到的混合液进行离心去除上清，通过清洗肿瘤细胞除掉不与肿瘤细胞结合的游离的CpG寡聚脱氧核苷酸，即得到胞外诱捕网化肿瘤细胞；4)将制备得到的胞外诱捕网化肿瘤细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭光宏，黄风迎，张立明，吕卓璇，林映莹，
申请(专利权)人：海南医学院，
类型：发明
国别省市：海南,46