一种多基因重组嵌合抗原受体分子制造技术

本发明专利技术涉及分子生物学领域，尤其涉及一种多基因重组嵌合抗原受体分子；本发明专利技术的多基因重组嵌合抗原受体分子，包括：1)两个通过连接肽相连的、结合肿瘤细胞表面和/或肿瘤基质细胞表面的免疫抑制分子的肽段的胞外区和跨膜区结构域；以及2)共刺激信号分子胞内结构域肽段；本发明专利技术的多基因重组嵌合抗原受体分子，具有完整表达、保持识别、结合功能的特异性，同时具有活化T细胞作用和生存能力延长功能。

A Recombinant Chimeric Antigen Receptor Molecule with Multiple Genes

【技术实现步骤摘要】
一种多基因重组嵌合抗原受体分子
本专利技术涉及分子生物学领域，尤其涉及一种多基因重组嵌合抗原受体分子。
技术介绍
恶性肿瘤是一种严重威胁人类生命的疾病。恶性肿瘤或癌症的发病机理多种多样，其共同的表现在于变异的肿瘤细胞不受机体免疫系统的清除，能够无限制的繁殖和扩散，破坏周围组织的正常细胞和功能。长期以来，医药学界在尝试医治和控制肿瘤疾病的病程方面做了大量的努力，但收效甚微。目前，在恶性肿瘤的治疗上，除根除手术外，主流医学界的临床辅助治疗手段仍然是放射线治疗、化学药物治疗和抗体治疗。现有的治疗手段，对于肿瘤的复发几乎无效。1985年，美国科学家尝试分离病人的单个核细胞，并在体外用各种细胞因子诱导、激活、产生杀伤性T细胞(Cytokine-inducedkillercells，CIK)，继而发现这些细胞通过静脉滴注回输给病人后，对肿瘤的生长有杀伤作用。经过近三十年的临床应用和技术发展，用免疫杀伤细胞治疗肿瘤已经成为第四种公认的恶性肿瘤辅助治疗手段。常见的用于临床治疗的免疫杀伤细胞：自然杀伤细胞(Naturalkillercells，NK)、γδT细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CytotoxicTlymphocytes，CTL)、NK样T淋巴细胞(Naturalkiller-likeTcells，NKT)、Th1效应细胞(Effectorcells)等。抗原提呈细胞之一树突状细胞(Dentriticcells，DC)也常用于免疫细胞治疗的应用，DC可以提高免疫杀伤细胞的特异性、加强免疫杀伤细胞的活力。免疫活性细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤效果，取决于肿瘤细胞膜表面的受体分子表达。例如，γδT细胞、细胞毒性T淋巴细胞、Th1效应细胞等是通过T细胞受体(TCR)识别肿瘤细胞表达的组织相容性复合物(MHC)或白细胞抗原(HLA)结合的“抗原”肽片段序列而实施杀伤的；对于不表达MHC或HLA的肿瘤细胞无杀伤作用。而NKT、NK和γδT细胞的杀伤作用通过其他受体(CD1d、KAR等)结合机制，不依赖于肿瘤细胞MHC的表达。与大部分正常组织细胞相似，很多种肿瘤细胞并不表达或弱表达MHC分子，因此肿瘤细胞膜表面MHC分子表达的多样性是免疫细胞治疗疗效及临床应用推广受限的原因之一。为了克服免疫杀伤细胞特异性低下的缺点，美国科学家专利技术一种转基因的方法：将识别肿瘤表面特异性抗原的单克隆抗体高变区序列在体外重组、亚克隆为单链抗体片段(Singlechainantibodyfragmentofvariableregions，scFv)，再与其他基因的跨膜蛋白片段和胞内信号肽融合形成人造的嵌合抗原受体(Chimericantigenreceptor，CAR)，转染至T细胞内而形成嵌合抗原受体T细胞(Chimericantigenreceptor，CAR-T)。早期CAR-T的信号肽是CD3受体的Zeta亚基，后来发现嵌合CD28、CD137等蛋白的胞内信号肽后能加强Zeta的作用并显著延长CAR-T细胞的体内生存时间。临床研究结果表明，不同单抗制备的转基因CAR-T细胞对不同肿瘤有不同程度的疗效，明显高于非特异性的免疫杀伤细胞；其中“抗CD19单抗-CAR-T”细胞对急、慢性淋巴性白血病的疗效达到93％。这是恶性肿瘤治疗领域的一项重大突破。CAR-T细胞在临床对其他实体瘤的治疗效果明显低于“抗CD19单抗-CAR-T”细胞对急、慢性淋巴性白血病的疗效。原因之一是淋巴性白血病癌细胞中95％都表达B细胞抗原CD19，而其他实体瘤细胞的特异性抗原表达在40-70％之间；所以在实体瘤的治疗中，单一的单抗CAR-T细胞不可能杀伤表达其他肿瘤特异性抗原的癌细胞。原因之二是免疫杀伤细胞通过血液/淋巴液循环浸润到实体肿瘤的速度和数目。原因之三是肿瘤组织细胞对免疫活性细胞的负调节作用。在正常情况下，人体的血液循环中存在少量的活性杀伤细胞，如NK，γδT细胞等，其作用在于清除衰老、变异的组织细胞或抵御病毒入侵。免疫细胞的活性主要受到T调节细胞(RegulatoryTcells，Treg)的控制，当T调节细胞的控制减弱时，会造成免疫功能亢进或产生自身免疫性疾病；当控制增强时，会使免疫功能低下，滋生肿瘤或其他病毒性皮肤病。目前确认的参与负调节的蛋白因子有细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(CytotoxicTlymphocyte-associatedantigen-4,CTLA4)和程序性死亡蛋白1/程序性死亡蛋白1配基1(Programmedcelldeathprotein1/Programmedcelldeathprotein1ligand1，PD-1/PD-L1)等分子。抑制性T调节细胞表达CTLA4，可以与免疫细胞DC和T细胞表面的B7族蛋白亚基相互作用，抑制免疫细胞功能。B7蛋白家族成员有B7-H1(PD-L1)，B7-H2(PD-1L2)等。B7-H1(PD-L1)也可以通过结合淋巴细胞PD-1分子，进一步抑制靶细胞的活性功能。PD-1和PD-L1相互作用对T细胞功能的抑制是免疫细胞治疗肿瘤的一个主要障碍。在大多数实体瘤组织中，癌细胞表达PD-L1/PD-1的水平增高，对浸润到癌组织的活化淋巴细胞产生直接的抑制，这也是肿瘤逃逸机体免疫监管的机制之一；活化T细胞表面PD-1的表达增加，更容易受到负调节的抑制。最新的抗体药物CTLA4单抗、PD-1单抗以及PD-L1单抗已被美国FDA批准临床治疗恶性肿瘤，其作用原理是阻断CTLA4/B7以及PD-1/PD-L1的相互结合，从而解除体内T调节细胞或癌细胞对活性T杀伤细胞的抑制，让体内免疫活性细胞对肿瘤细胞进行杀伤、清除。有研究表明，体外活化的免疫杀伤细胞与体内自然存在的组织浸润性T淋巴细胞(Tissueinfiltrationlymphocytes，TIL)不同，是高水平表达PD-1分子，这也许是阻碍循环免疫杀伤细胞杀伤实体瘤组织癌细胞的原因。在临床应用中，如果免疫细胞治疗联合使用抗CTLA和PD-1/PD-L1的单抗药物，可以明显提高免疫细胞治疗的疗效。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术的目的是提供一种具有完整表达、保持识别、结合功能的特异性，同时具有活化T细胞作用和生存能力延长功能多基因重组嵌合抗原受体分子。本专利技术第一方面提供一种多基因重组嵌合抗原受体分子，包括：1)两个通过连接肽相连的、结合肿瘤细胞表面和/或肿瘤基质细胞表面的免疫抑制分子的肽段的胞外区和跨膜区；以及2)共刺激信号分子胞内结构域肽段。进一步的，所述免疫抑制分子选自肿瘤细胞或肿瘤基质细胞膜蛋白，所述结合肿瘤细胞表面和/或肿瘤基质细胞表面的免疫抑制分子的肽段为相应免疫抑制分子的配体/受体天然肽段、或者单链抗体。进一步的，所述配体/受体天然肽段包括PD-1和PD-L1，所述单链抗体包括Anti-CD44-scFv。进一步的，所述多基因重组嵌合抗原受体分子的跨膜区选自PD-1或PD-L1或PD-L2的跨膜区。进一步的，所述共刺激信号分子胞内结构域肽段选自CD28、CD3zeta、CD137的胞内结构域肽段中的一种或多种。进一步的，所述多基因重组嵌合抗原受体分子还包括信号肽。信号肽可以提高多基因重组嵌合抗原受体分子这种融合蛋白分泌的效果，在信号本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多基因重组嵌合抗原受体分子，其特征在于包括：1)一个识别细胞膜抗原蛋白的单链抗体，通过连接肽相连一个免疫检查点抑制性分子PD‑1、PD‑L1或PD‑L2多肽链的胞外区和跨膜区；以及2)分泌信号肽；以及3)共刺激信号分子和信号分子CD3 Zeta胞内结构域肽段；所述多基因重组嵌合抗原受体分子的氨基酸序列为SEQIDNO：11、SEQID NO：12或SEQIDNO：13所示的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种多基因重组嵌合抗原受体分子，其特征在于包括：1)一个识别细胞膜抗原蛋白的单链抗体，通过连接肽相连一个免疫检查点抑制性分子PD-1、PD-L1或PD-L2多肽链的胞外区和跨膜区；以及2)分泌信号肽；以及3)共刺激信号分子和信号分子CD3Zeta胞内结构域肽段；所述多基因重组嵌合抗原受体分子的氨基酸序列为SEQIDNO：11、SEQIDNO：12或SEQIDNO：13所示的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的多基因重组嵌合抗原受体分子，其单链抗体为小鼠抗人CD19单链抗体，通过连接肽相连的胞外区和跨膜区是PD-1蛋白或PD-L1的天然肽段，其胞内结构域肽段包括共刺激信号分子CD28和信号分子CD3Zeta胞内结构域肽段。3.根据权利要求2所述的多基因重组嵌合抗原受体分子，其特征在于：所述单链抗体包括Anti-CD44-scFv；所述相连肽链连接包括P...

【专利技术属性】
技术研发人员：郝晓勇，黄招琴，
申请(专利权)人：海门郝怡雅医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32