一种针对CD19+肿瘤的多功能融合蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种针对CD19+肿瘤的融合蛋白，其中包括特异性识别CD19抗原的抗体功能区、屏蔽肿瘤免疫抑制抗原CD47信号的SIRPα胞外功能区、结合Fc受体的高亲和力IgG1Fc以及用于连接功能区的非功能性氨基酸片段；本发明专利技术还涉及上述融合蛋白的制备和应用。本发明专利技术所述的重组融合蛋白既能识别CD19阳性的肿瘤细胞，又能屏蔽CD47免疫抑制信号通路，同时高亲和力的Fc部分可以增强免疫细胞对肿瘤的免疫反应，具有很好的临床前景和广泛的应用范围。

A Multifunctional Fusion Protein for CD19+ Tumor and Its Application

【技术实现步骤摘要】
一种针对CD19+肿瘤的多功能融合蛋白及其应用
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种针对CD19阳性肿瘤的多功能融合蛋白及其在治疗癌症中的应用。
技术介绍
各种肿瘤通过CD47/SIRPα信号通路的激活来逃避免疫控制(CancerRes.2011；71(4)：1374–84)。高表达CD47的肿瘤细胞可以抑制表达SIRPα巨噬细胞对肿瘤的吞噬作用，进而降低抗原递呈细胞的功能，影响机体对肿瘤的次生性免疫活性(NatMed.2015；21(10)：1209–15)，所以肿瘤CD47表达的密度与癌症患者的临床结果成负相关性(Cell.2009；138(2)：286–99)。利用针对CD47的抗体药物来屏蔽CD47/SIRPα信号通路可以增加巨噬细胞对肿瘤的吞噬作用(Cell.2010；142(5)：699–713)。但是，由于CD47普遍在红细胞和血小板中表达，所以单纯屏蔽CD47/SIRPα不但会引起严重的副作用(Blood.2006；107(6)：2548–56)，也需要更大剂量的抗体药物才能达到屏蔽的目的(JExpMed2001，193：855–862)。同时，由于抗体的亲和力较高，单纯利用抗体的免疫抑制作用会造成对表达CD47正常细胞的清除，例如导致红细胞缺少，造成极度贫血现象(eLife2017；6：e18173)。由于SIRPα与CD47亲和力较弱和机体内巨量表达CD47的细胞的存在，所以单纯利用SIRPα进行屏蔽CD47的效果也不理想，临床效果也差。截止目前，临床上还没有一种利用高亲和力片段增加靶细胞周围蛋白量而达到阻断低亲和力抑制信号通路的蛋白药物，而单一功能针对CD19阳性肿瘤细胞的药物又存在疗效低的缺点。本专利技术的融合蛋白可以克服以上不足，替补这一领域空白。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有临床药物的不足，合成一种融合蛋白，该蛋白包含针对CD19的抗体部分和针对CD47的SIRPα片段。利用抗体与CD19的高亲和力识别与结合CD19阳性的肿瘤细胞，增加肿瘤细胞附近的SIRPα蛋白浓度，促进低亲和力SIRPα与CD47的结合，达到完全屏蔽CD47信号的功能，减少因肿瘤细胞高表达CD47而产生的免疫抑制，增加免疫细胞识别与吞噬CD19阳性肿瘤细胞的功能。本专利技术所提供的一种针对CD19肿瘤细胞的多功能融合蛋白，能增加对低亲和抑制信号通路的阻断作用，提高免疫细胞对肿瘤的吞噬，从而可以提高免疫系统对肿瘤的抑制及清除，提高临床应用的疗效。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的第一个目的是提供一种针对CD19+肿瘤的多功能融合蛋白，其包括识别肿瘤抗原CD19的抗体功能区、屏蔽肿瘤表面免疫抑制蛋白的SIRPα胞外功能区、结合免疫细胞Fc受体的功能区以及用于连接功能区的非功能性氨基酸片段。上述三个功能区通过非功能性氨基酸片段连接，从而避免各个功能区的蛋白折叠与功能相互干扰，能同时与肿瘤的CD47和CD19结合，增强NK细胞的ADCC效应和巨噬细胞的ADCP效应，促进对肿瘤组织的杀伤和清除，发挥融合蛋白的多功能特征。为了进一步优化上述多功能融合蛋白，本专利技术采取的技术措施还包括：进一步地，所述识别肿瘤抗原CD19的抗体为能够特异性识别肿瘤细胞抗原CD19的抗体；具体为针对CD19的单链抗体可变区。进一步地，所述肿瘤表面免疫抑制蛋白为CD47，融合蛋白屏蔽CD47的胞外功能区为SIRPα，其免疫检查点通路是指CD47/SIRPα信号通路。此类抑制性受体CD47在肿瘤细胞表面过度表达，造成肿瘤细胞逃避免疫细胞的杀伤与清除。融合蛋白SIRPα片段部分阻断免疫细胞SIRPα与CD47的结合，进而阻断抑制性信号传递。融合蛋白抗体部分结合肿瘤细胞的CD19抗原，增加蛋白SIRPα片段在肿瘤组织周围的富集，增强对肿瘤CD47的结合与信号屏蔽强度。进一步地，所述免疫细胞的结合区为IgG1Fc，能够高亲和结合免疫细胞Fc受体。其中，通过IgG1Fc与Fc受体结合，促进肿瘤靶细胞周围的免疫细胞ADCC和ADCP反应，增强杀伤性免疫细胞对肿瘤靶细胞的杀伤效应，同时防止单靶点结合而导致的脱靶效应。进一步地，所述融合蛋白的功能区由氨基酸灵活片段连接，保证各个功能区的功能相对独立，连接所述融合蛋白功能区的氨基酸序列包括SEQIDNO：5所示序列。进一步地，所述SIRPα完整的氨基酸序列为SEQIDNO：1(GenBank:BC038510.2)所示序列。进一步地，所述CD19抗体scFv重链Fab完整的氨基酸序列为SEQIDNO：2(SequenceID:AAB34429.1)所示序列。进一步地，所述CD19抗体scFv轻链Fab完整的氨基酸序列为SEQIDNO：3(GenBank:AAB34430.1)所示序列。进一步地，所述融合蛋白中人IgG1Fc完整的氨基酸序列为SEQIDNO：4(GenBank:4X4M_A)所示序列。更进一步地，所述SIRPα的氨基酸序列为SEQIDNO：1所示序列中的31-150位点一个或多个重复片段，或具有类似功能的突变体；所述CD19抗体重链Fab的氨基酸序列为SEQIDNO：2所示序列中的1-121位点一个或多个重复，或具有类似功能的突变体；所述CD19抗体轻链Fab的氨基酸序列为SEQIDNO：3所示序列中的1-114位点一个或多个重复，或具有类似功能的突变体；所述IgG1Fc的氨基酸序列为SEQIDNO：4所示序列中的3-219位点或具有类似功能的突变体；所述用于连接功能区的氨基酸序列为SEQIDNO：5所示序列位点一个或多个重复序列。进一步地，所述多功能融合蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO：6所示序列或具有类似功能的突变体。上述各氨基酸的序列如下表所示：进一步地，制备所述融合蛋白的步骤包括：步骤1)通过人工合成的方式合成SEQIDNO：6所示氨基酸序列相对应的碱基，组成融合蛋白构造基因；步骤2)将步骤1)所述的融合蛋白构造基因转入哺乳动物表达载体，并转染至仓鼠卵巢细胞(CHO)进行蛋白表达；步骤3)将步骤2)所述的仓鼠卵巢细胞放置在孵箱中培养一段时间，取上清液，通过层析纯化后制得重组融合蛋白。进一步地，所述融合蛋白构造基因的构建步骤包括：根据SIRPα、抗CD19的Fab和IgG1Fc的功能区氨基酸相对应的碱基，通过基因合成与非功能氨基酸片段碱基连接成多功能融合蛋白构造基因；进一步地，所述哺乳动物表达载体为真核动物表达载体pCDNA3.1(-)。进一步地，所述步骤3)的具体操作如下：转染的仓鼠卵巢细胞细胞置于37℃、5％CO2孵箱中培养，72小时后取上清液，通过ProteinA亲和层析纯化，获得多功能重组融合蛋白。本专利技术的第二个目的是提供一种任一上述的多功能融合蛋白的用于治疗表达CD47和CD19的肿瘤临床应用。进一步地，所述应用为融合蛋白的单独应用或与化疗、靶向药物、抗体药物、细胞治疗组成的联合应用，以用于制备治疗表达CD19和CD47肿瘤而引起的疾病的药物。进一步地，所述疾病包括所有具有高表达CD19和CD47抗原的肿瘤。与现有技术相比，本专利技术所述的融合蛋白具有以下有益效果：本专利技术所制得的多功能融合蛋白，利用高亲和力的抗CD19抗体部分结合肿瘤细胞，促进肿瘤细胞周围的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种针对CD19+肿瘤的多功能融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括识别肿瘤抗原CD19的抗体功能区、屏蔽肿瘤表面免疫抑制蛋白CD47的功能区、结合免疫细胞Fc受体的功能区以及用于连接各功能区的氨基酸片段。

【技术特征摘要】
1.一种针对CD19+肿瘤的多功能融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括识别肿瘤抗原CD19的抗体功能区、屏蔽肿瘤表面免疫抑制蛋白CD47的功能区、结合免疫细胞Fc受体的功能区以及用于连接各功能区的氨基酸片段。2.根据权利要求1所述的多功能融合蛋白，其特征在于，所述识别肿瘤抗原的抗体为针对CD19的单链抗体可变区；所述屏蔽CD47的融合蛋白功能区为SIRPα；所述与免疫细胞的结合区为融合蛋白的IgG1Fc片段。3.根据权利要求2所述的多功能融合蛋白，其特征在于，所述SIRPα完整的氨基酸序列为SEQIDNO：1所示序列；所述CD19抗体的重链Fab完整的氨基酸序列为SEQIDNO：2所示序列；所述CD19抗体的轻链Fab完整的氨基酸序列为SEQIDNO：3所示序列；所述IgG1Fc完整的氨基酸序列为SEQIDNO：4所示序列。4.根据权利要求3所述的多功能融合蛋白，其特征在于，所述SIRPα的氨基酸序列为SEQIDNO：1所示序列中的31-150位点或多个序列重复或含有类似功能突变体；所述CD19抗体scFv的重链氨基酸序列为SEQIDNO：2所示序列中的1-121位点或多个序列重复或类似功能的突变体；所述CD19抗体scFv的轻链氨基酸序列为SEQIDNO：3所示序列中的1-114位点或多个序列重复类似功能的突变体；所述IgG1Fc的氨基酸序列为SEQIDNO：4所示序列中的3...

【专利技术属性】
技术研发人员：岳喜连，张传能，张朝宾，徐圣涛，吴国祥，
申请(专利权)人：上海科弈药业科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31