一种抗肿瘤蛋白及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供一种抗肿瘤蛋白ＲＥ２６，其分子量约为２６ｋＤ，等电点为４．３。其制备方法包括：粗分离得到ＲＥ２６的粗提物，使用三次离子交换层析进一步分离纯化得到ＲＥ２６蛋白纯品，用于在制备治疗、诊断和研究肿瘤特别是淋巴瘤性疾病的药物或试剂中的用途。本发明专利技术的抗肿瘤蛋白ＲＥ２６有较专一识别淋巴瘤细胞并诱导其凋亡的活性，为治疗、诊断和研究肿瘤疾病特别是淋巴瘤疾病提供了一种新途径。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种蛋白及其制备方法，特别是一种来源于真菌的抗淋巴瘤蛋白及其制备方法。
技术介绍
恶性淋巴瘤属于恶性肿瘤的一种，往往发生在年轻、壮年，对劳动力的影响非常 大，因此引起了医学界特别的重视，发病的年龄是20岁到40岁的青壮年比较多见平均死亡 年龄都大大低于45岁。 淋巴瘤是起源于淋巴系统的恶性肿瘤，分为霍奇金病和非霍奇金淋巴瘤两大类。 它的发生与淋巴细胞增殖分化产生的免疫细胞恶变有关，其病因目前尚未完全明确，可能 与一些病毒的感染有关，比如EB病毒、肝炎病毒以及幽门螺旋杆菌病毒等。 目前，全球平均每9分钟就有1个新发病人。我国淋巴瘤发病率为0. 02%。。每年 新增患者约2. 5万人，死亡人数近2万，淋巴瘤的威胁正在迅速显现。在亚洲地区，非霍奇 金淋巴瘤发生率远高于霍奇金氏病，大约为9 : 1，由于恶性程度更高、预后更差，所以一般 谈到淋巴瘤就是指非霍奇金淋巴瘤。在我国，在恶性肿瘤发病率排名中，男性占第9位，女 性占第10位。早期单药治疗非霍奇金淋巴瘤，治疗效果不明显，而且极易复发，患者存活率 低。自1976年开始用CHOP方案(环磷酰胺、阿霉素、长春新碱、泼尼松)治疗以来，其5年 生存率上升到30 % 40 % ，总体缓解率80 % 90 % 。在造血干细胞移植应用于治疗非霍 奇金淋巴瘤后，进一步提高了治愈率。但上述治疗方法易损伤正常组织，特别是伤害在抗肿 瘤机制中占重要地位的机体免疫系统，而且常难彻底消灭肿瘤细胞，很多临床证据表明，残 留或移植时回输的肿瘤细胞是导致复发的主要原因，患者生存期因而縮短。目前，随着医学 的发展，生物治疗因其靶向性以及能达到体内肿瘤细胞的极微量残留，且副作用小等优点 而将成为一种前景很好的新的治疗方法。 人们已经从真菌中发现了较多的抗肿瘤活性物质或成分，这些真菌包括一些大型 的可食用菌类如香菇、巴西蘑菇、阿魏蘑菇、灵芝等，也包括有一些虫体内生真菌、植物内生 或共生真菌以及海洋真菌等。发现的抗肿瘤物质有多糖、蛋白\肽类、小分子化合物以及一 些尚不明确的成份。 紫铍盖罗鳞伞又叫喜山罗鳞伞(Rozites emodensis (Berk. )Moser)是一类产自较 高海拔地区的可食用大型野生菇类(蕈类)，在云南、西藏、四川均有分布。本专利技术从该蕈体 内分离出一类分子量约为26kD的蛋白质，具有较为专一的抗淋巴瘤活性，未见现有文献报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种抗肿瘤蛋白RE26，其N末端封闭，肽链中含有SEQID N0: 1所示的序列NGLEEEETLLLLFFPP和SEQ ID NO :2所示序列NGTEQE，来源于紫皱盖罗鳞伞 (Rozites emodensis (Berk. )Moser)子实体，并在子实体展开的伞盖中具有高含量，所述蛋白的分子量为26kD，等电点为4. 3。 进一步的，所述蛋白经羟胺切割后得到24kD和17kD两条片段，24kD片段N段氨基酸序列如SEQ ID NO :1， 17kD片段N端序列如SEQ ID NO :2所示。 所述蛋白可以特异识别并诱导肿瘤细胞特别是淋巴瘤细胞凋亡。 本专利技术的另一方面，涉及制备上述蛋白的方法，包括 1)获得RE26粗提液采取紫铍盖罗鳞伞(Rozites emodensis (Berk. )Moser)新 鲜子实体，用蒸馏水洗净、沥干，加于一倍体积的PH 8. 0的0. 02mol/lTris-HCl缓冲液，4°C 匀浆并温和搅拌过夜，离心后，将上清过滤去悬浮物即获得RE26粗提液。 2)分离纯化步骤1)的RE26粗提液，获得RE26蛋白纯品。 步骤2)所述的分离纯化方法为离子交换层析，先用填料粒径为45-300 y m阴离子 或阳离子交换树脂对RE26粗提液进行粗分离，再用填料粒径为15-45 y m的阴离子或阳离 子交换树脂进一步分离得到RE26纯品。 这里需要指出的是，本专利技术给出的天然来源的RE26蛋白的制备方案不是获得 天然RE26的唯一方案。由于大多数蛋白质为酸性蛋白，在发现紫皱盖罗鳞伞(Rozites emodensis (Berk. )Moser)提取物即RE26粗提液具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用的前提下， 利用本领域技术人员所熟知的各种蛋白纯化方法(如硫酸铵沉淀、亲和层析、疏水层析、反 相层析)应用于本专利技术方案各步骤的增减、替换以及顺序调换，可以容易的将目的蛋白分 离纯化，得到蛋白RE26的纯品。 根据本专利技术的一方面，本专利技术的蛋白具有能专一结合并高效抑制淋巴瘤细胞的活 性，所述蛋白可以用于制备治疗肿瘤特别是淋巴瘤的药物。 本专利技术的再一个目的是提供所述蛋白在制备诊断和研究肿瘤疾病，特别是淋巴瘤 的试剂中的用途。 RE26是从一类可食用野生蕈类紫铍盖罗鳞伞(Rozites emodensis (Berk. )Moser) 中分离得到的一类专一识别并高效抑制淋巴细胞来源肿瘤的蛋白质，其分子量为26kD，等 电点为4. 3。实验证实，RE26在体外对多种淋巴瘤细胞(包括鼠源和人源)均具有高抑制 作用，但对各种正常细胞以及其它组织来源的肿瘤细胞则毒性较小。使用倍比稀释法和MTT 法测定RE26对常见的淋巴瘤细胞如Raji、EL-4和YAC-1的半抑制浓度(MIC5。)为3_4 y g/ ml，而对其它常见细胞的则至少大于30 ii g/ml。用荧光染料FITC标记RE26分子后，再作 用于各种细胞，仅发现淋巴瘤细胞出现大量荧光，证明RE26能专一作用于淋巴瘤细胞，利 用该性质，可以将RE26应用于淋巴瘤细胞特异性识别的研究和诊断领域。使用凋亡试剂盒 和流式细胞术检测RE26对细胞的作用，发现在RE26作用于细胞2h时，淋巴瘤细胞出现明 显的凋亡。检测RE26处理后细胞的三种重要凋亡酶Caspase3、Caspase8和Caspase9的活 性，发现均有较明显的升高。在初步的动物毒性实验中，连续尾静脉注射RE26溶液于健康 小鼠14天，未观察到异常反应，体重与正常组保持一致。使用裸鼠进行RE26抗淋巴瘤体内 实验表明，RE26能有效地抑制Raji细胞在体内的成瘤。热稳定性测试实验证实，RE26在 60°C以下活性稳定。这些实验表明RE26对淋巴瘤细胞具较为专一的识别作用，并能通过诱 导淋巴瘤细胞凋亡而对其高效抑制，而对其它类型细胞则毒性很低，因此，RE26蛋白在淋巴 瘤细胞的识别、淋巴瘤疾病的诊断以及治疗上应用前景看好。从RE26的来源、特征、活性等 方面进行文献查新，未发现任何相同或相似的报道。附图说明 图1.使用S印harose Fast Flow Q柱进行第一次离子交换分离 流动相A :0. 02mol/l Tris-HCl缓冲液，pH8. 0 ; 流动相B :0. 02mol/l Tris-HCl缓冲液，pH8. O，含lmol/1 NaCl ; 流速5ml/min ; 穿透峰洗脱后，依次使用7% B、30% B洗脱样品，收集30%洗脱峰。 图2.使用RESOURCE 15Q 4. 6/100柱对RE26进行第二次阴离子交换分离。 流动相A :0. 02mol/l Tris-HCl缓冲液，pH8. 0 ;流动相B :0. 02mol/l Tris-HCl缓冲液，pH8.本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗肿瘤蛋白ＲＥ２６，其特征在于：其Ｎ末端封闭，肽链中含有ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１所示的序列ＮＧＬＥＥＥＥＴＬＬＬＬＦＦＰＰ和ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２所示序列ＮＧＴＥＱＥ。

【技术特征摘要】
一种抗肿瘤蛋白RE26，其特征在于其N末端封闭，肽链中含有SEQID NO1所示的序列NGLEEEETLLLLFFPP和SEQ ID NO2所示序列NGTEQE。2. 根据权利要求l所述的蛋白，其特征是所述蛋白来源于紫皱盖罗鳞伞(Rozites emodensis (Berk. )Moser)。3. 根据权利要求1所述的蛋白，其特征是分子量为26kD，等电点为4. 3。4. 根据权利要求1所述的蛋白，其特征是经羟胺切割后得到24kD和17kD两条片段， 24kD片段N段氨基酸序列如SEQ ID NO :1， 17kD片段N端序列如SEQ ID N0:2所示。5. 根据权利要求1 4任一一项所述蛋白，其特征是所述蛋白可以特异识别并诱导 肿瘤细胞凋亡。6. 根据权利要求5所述蛋白，其特征是所述肿瘤细胞为淋巴瘤细胞。7. 制备如权利要求1 6任一一项所述蛋白的方法，包括1) 获得RE26粗提液采取紫皱盖罗鳞伞(Rozit...

【专利技术属性】
技术研发人员：龚萌，刘旭阳，曹桂群，程惊秋，
申请(专利权)人：四川大学华西医院，
类型：发明
国别省市：90[中国|成都]