一种兼具调节免疫、抗氧化、抗炎和解毒多功能的杂合肽及其制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及一种兼具调节免疫、抗氧化、抗炎和解毒功能的杂合肽及其制备方法与应用。本发明专利技术提供的杂合肽命名为LTP，其为抗菌肽LL‑37和胸腺五肽TP5经蛋白质工程计算机设计、杂合、优化、体内外复筛得到，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。该杂合肽LTP具有较高的双向免疫调节活性，能够增强正常或免疫抑制状态下机体的免疫功能，保护免疫抑制对机体造成的损伤；在炎症状态下，LTP还可中和消解内毒素、抑制机体的氧化反应及炎症反应，缓解炎症反应对组织的损伤，且具有细胞毒性低、安全性高，制备方法简单、成本低廉等优势，可作为理想的免疫、抗氧化、抗炎调节剂或免疫抗氧化解毒肽，具有很好的应用潜力和价值。

A heterozygous peptide with functions of regulating immunity, anti-oxidation, anti-inflammation and detoxification, and its preparation method and Application

【技术实现步骤摘要】
一种兼具调节免疫、抗氧化、抗炎和解毒多功能的杂合肽及其制备方法与应用
本专利技术涉及基因工程及生物制剂领域，具体涉及一种具有免疫调节、抗氧化，抗炎和消解功能的免疫抗氧化解毒杂合肽及其制备方法与应用。
技术介绍
动物或人类在幼龄、体弱、疾病、应激、病原感染等情况下，经常导致免疫力降低，进而发生继发感染(细菌或病毒混合感染)，引起炎性反应(红、热、肿、痛等)。目前，对于感染和炎症治疗，传统又普遍使用的防治策略是使用抗生素和激素类抗炎药(如氢化可的松、地塞米松等)，虽能有效控制感染性炎症和非感染性炎症,但持续使用可引起多种副作用：如水盐代谢和糖、脂肪、蛋白质代谢的严重紊乱，并引起肾上腺皮质功能衰退、消化系统并发症或加重感染等。另外，畜牧养殖业中广泛使用抗生素保健促生长剂。在感染和炎症治疗中使用抗生素或激素类抗炎药存在明显的问题：抗生素虽然能降低或杀死病原菌，但不能改善机体的免疫功能，相反，被抗生素杀死的病菌还可能产生内毒素或外毒素，进而加重炎症反应甚至导致全身性炎症反应综合征(Botwinski,2001)，轻则引起动物发热、厌食、体内能量过度消耗、体组织分解，免疫力和生产性能下降，重则可能导致畜禽死亡(Botwinski,2001；Zinner,1999)。近年来大量研究表明，许多抗生素在杀死细菌的同时，也能促使内毒素即脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)从细菌细胞膜上释放出来(Holzheimer,2001；Hurley,1995)，进而导致LPS大量聚集，引起炎症反应。内毒素LPS通常由致病性大肠杆菌、沙门氏杆菌、布氏杆菌、变形杆菌、猪流感与副猪嗜血杆菌等革兰氏阴性菌的细胞崩解产生，能诱发多种机体促炎细胞因子的释放，如TNF-α、白介素6(IL-6)和IL-1β等；同时还会诱导产生大量自由基导致氧化损伤，进而降低免疫力。因此，减少或消除内毒素LPS，并通过抗氧化功能减少机体氧化损伤，降低或消除患病动物或人的炎症反应。综上所述，目前的抗生素抗感染和糖皮质激素类抗炎药都存在明显缺陷，不宜持续使用。因此，开发一种新型、安全、无副作用、环保且同时具备免疫调节、抗氧化、抗炎功能和消解内毒素的活性肽，对人类或动物养殖业具有重要的现实意义和巨大的应用前景，是抗感染策略的新突破和新理念。免疫系统可以通过免疫防御功能来保护机体免受外来微生物的入侵，同时能够及时清除体内衰老及癌变的细胞。一方面，当免疫功能低于正常水平时，机体极易被感染并诱发恶性肿瘤等的产生，从而使患者的病情加重难以治疗；但是另一方面，当免疫反应过度时会引起动物或人体强烈的炎症反应，导致机体损伤及各生理系统功能紊乱，进而影响机体正常的代谢过程，严重者甚至危及生命。由此可见，抗炎与免疫是免疫系统功能的两个方面，密切相关，不可分割，有时甚至是相互重叠的。因此，传统医药领域中，将抗炎药和免疫增强药截然分开是不符合机体实际需要或抗炎与免疫的相互作用关系的，并且大大增加了临床选药的复杂性和拮抗性。鉴于上述情况，开发安全高效、具有双向免疫调节功能的制剂或药物来改善动物和人体的免疫机能具有重要意义。抗菌肽LL-37，是相对分子质量约5000Da(道尔顿)的多肽，是迄今在人体中发现的抗菌肽(cathelicidin)家族中的唯一成员，也是人体内唯一具有双亲性α螺旋结构的抗菌肽。LL-37广泛分布在人体的血液细胞和上皮细胞中，具有中和内毒素的作用，能与LPS和CD14结合，中和LPS的生物毒性；能够介导趋化作用，招募免疫细胞到达感染部位，清除病原物；以及促进血管生成等作用，是一类研究比较成熟的抗炎肽。人类对于免疫活性肽的研究始于1981年，Jolles等首次从人乳蛋白水解物中分离得到一种具有免疫活性的肽段。此后，科学家们进行了大量的免疫活性肽方面的研究，其中，以胸腺肽研究报道较多，也较为深入。胸腺五肽(TP5)，即胸腺生成素II的活性中心，具有与胸腺生成素相似的生物性学活性，能双向调节失衡的免疫功能、诱导细胞分化、促进淋巴细胞亚群发育并活化，是一种重要的免疫调节剂。随着对抗炎肽及免疫增强肽的结构、功能与作用机理研究的不断深入，科研人员开始尝试利用蛋白质工程方法设计安全性更高、调节活性更强的双向免疫调节肽。已有研究报道通过将不同类型的多肽进行杂合是获得多功能新型多肽或将不同免疫活性肽和抗炎肽杂合获得新型免疫抗炎调节药物。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术的目的是提供一种兼具调节免疫、抗氧化、抗炎和解毒多功能的杂合肽及其制备方法与应用为实现上述目的，本专利技术的技术方案如下：本专利技术在对多肽LL-37和胸腺肽TP5的序列、结构以及序列结构与功能的关系进行大量研究的基础上，运用蛋白质分子设计技术进行多肽LL-37(氨基酸序列如SEQIDNO.3所示)和胸腺五肽TP5(氨基酸序列如SEQIDNO.4所示)的杂合优化，通过对杂合肽的筛选和序列优化，最终获得一种新型的免疫解毒杂合肽，命名为LTP，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。杂合肽LTP同时具有两个母源肽的功能，即具有双向免疫调节功能：在正常或免疫抑制状态下，能够提高机体的免疫功能；在炎症或内毒素存在状态下，LTP还可抗氧化、消解内毒素、并抑制机体炎症反应。首先，本专利技术提供的免疫解毒杂合肽LTP的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示或为如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能多肽的氨基酸序列。上述在如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列的基础上进行改造获得的具有相同功能的杂合肽LTP的衍生多肽包括但不限于如下多肽：(1)在如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列的C端或N端添加蛋白标签序列得到的多肽，例如：在如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列的C端或N端添加含有6个His残基的His标签得到的多肽；或在如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列的C端或N端添加GST或C-Myc标签得到的多肽；本领域技术人员应该理解，为实现易于纯化、多肽标记等目的，在多肽的两端添加标签序列是本领域的常规技术手段，并不会对多肽本身固有的功能和活性造成影响，因此，上述在如SEQIDNO.1所示的杂合肽LTP的两端添加标签序列得到的LTP衍生物也在本专利技术的保护范围内。(2)在如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸序列的保守性氨基酸替换得到的多肽，例如：将第15位的Leu替换为Ile不会对蛋白的功能造成实质改变。本专利技术还提供编码所述具有免疫调节、抗氧化、消解内毒素和抗炎功能的杂合肽的基因。在已知杂合肽LTP的氨基酸序列的情况下，本领域技术人员可以根据对于多肽表达的需要，基于密码子的简并性原则和不同物种对于密码子的使用偏好性，设计具有不同核苷酸序列的杂合肽LTP的编码基因。作为本专利技术的一种实施方式，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。如SEQIDNO.2所示的基因为根据毕赤酵母的密码子偏好性设计的杂合肽LTP编码基因。与SEQIDNO.2具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同源性的编码相同功能蛋白的基因序列也属于本专利技术的保护范围。进一步地，本专利技术还提供含有所述杂合肽编码基因的生物材料，所述生物材料包括重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种免疫抗氧化解毒杂合肽，其特征在于，所述杂合肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示或为如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能多肽的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种免疫抗氧化解毒杂合肽，其特征在于，所述杂合肽的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示或为如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能多肽的氨基酸序列。2.编码权利要求1所述杂合肽的基因。3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，或与SEQIDNO.2具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同源性的编码相同功能蛋白的基因序列。4.含有权利要求2或3所述基因的生物材料，其特征在于，所述生物材料包括重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体或宿主细胞。5.制备权利要求1所述杂合肽的方法，其特征在于，包括：将权利要求2或3所...

【专利技术属性】
技术研发人员：张日俊，张璐璐，卫旭彪，黄燕，阿曼，斯大勇，李仲玄，程俊豪，杜孟思，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11