本发明专利技术公开了一株海洋真菌哈茨木霉（Trichoderma harzianum）DLEN2008005及其应用。所述海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005于2016年1月29日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.12105；保藏地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所。该菌株及其培养物具有抗氧化和抑制乙酰胆碱酯酶的活性，在制备抗老年痴呆药物方面，以及在制备抗氧化药物和/或抑制乙酰胆碱酯酶活性的药物方面具有很好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物
更具体地，涉及一株海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005及其应用。
技术介绍
随着世界人口老龄化的加剧和老年痴呆（Alzheimer’sDisease,AD）发病率的不断增加，寻找抗老年痴呆的新药已迫在眉睫。
目前，被广泛接受的老年痴呆病理理论是胆碱能神经损伤假说。在该理论的指导下，乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase，AChE）抑制剂是目前应用最广的抗老年痴呆症药物。同时不少研究发现，需氧细胞代谢过程中产生的超氧自由基会对脑组织造成损害，促进脑细胞的衰老和死亡，而且自由基还能损害细胞染色体，使第21号染色体畸变，从而发生AD。而抗氧化剂不仅能够稳定细胞膜，消除活性氧，同时还能抑制和清除脑内β淀粉样蛋白沉积，从而来预防和保护神经细胞免受损伤，从而延缓AD的发展进程。
因为乙酰胆碱酯酶抑制剂和抗氧化剂均有治疗或延缓AD的作用，因此筛选具有抑制AChE活性和抗氧化双重功能的药物具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有老年痴呆治疗药物的不足，提供一株海洋真菌哈茨木霉（Trichodermaharzianum）DLEN2008005及其应用，该菌株及其培养物具有很好的抗氧化和抑制乙酰胆碱酯酶活性，在制备抗老年痴呆药物方面具有很好的应用前景。
本专利技术的目的是提供一株海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005。
本专利技术另一目的是提供上述海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005的应用。
本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：
一株海洋真菌哈茨木霉（Trichodermaharzianum）DLEN2008005，于2016年1月29日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（其简称为CGMCC），保藏编号为：CGMCCNo.12105；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
所述海洋真菌哈茨木霉（Trichodermaharzianum）DLEN2008005是从中国大连海域的潮间带海藻龙须菜藻体组织内分离获得，具有抗氧化和抑制乙酰胆碱酯酶作用，依据《真菌鉴定手册》（魏景超，1979）鉴定为Trichodermaharzianum菌株。
另外，该菌株的ITS1-5.8S-ITS2rDNA序列如SEQIDNO.1所示。
该菌株具有下述性质：接种到海水马铃薯蔗糖培养基（海水PSA）平板上，28℃培养，菌落开始为白絮状，圆形，向四周扩展，后从菌落中央向边缘产生灰绿色孢子，菌落边缘颜色略浅，整个菌落呈松散絮状；显微镜下菌丝纤细无色，具分隔，多分枝；分生孢子梗从菌丝的侧枝上生出，对生或互生，一般有2～3次分枝，着生分生孢子的小梗瓶形或锥形；分生孢子多为球形，孢壁具小疣突，蓝绿色；最佳生长温度范围26～30℃，最佳生长pH为6.0～7.0，可利用葡萄糖、蔗糖、乳糖等碳源；该菌株在海水马铃薯蔗糖液体培养基中静置发酵可产生抗氧化和乙酰胆碱酯酶抑制剂活性物质。
该菌株的生长盐浓度范围为2.0%～5.0%。
另外，上述海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005应用，具体是在制备抗老年痴呆药物中的应用，以及在制备抗氧化药物和/或抑制乙酰胆碱酯酶活性的药物中的应用，也在本专利技术的保护范围之内。
一种海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005的培养物，包含菌体和菌体发酵培养产物。
进一步地，所述培养物是通过将海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005接种于灭菌的液体培养基中，自然光照28℃培养21～24天获得；其中，所述液体培养基的制备方法为：每500mL马铃薯煮汁中加入20.0g蔗糖和20.0g海盐，自然pH值；所述马铃薯煮汁为：取新鲜马铃薯去皮切成1cm3大小块状，每200g马铃薯块加蒸馏水500mL煮沸20min，双层脱脂纱布过滤，并以蒸馏水定容至500mL。
更优选具体地，所述培养物的获得方法如下：
（1）种子培养：将菌种从斜面上接种到无菌的种子固体培养基平板上，将培养皿平板置于恒温培养箱中28℃下倒置培养，培养时间为4～5天；
（2）扩大培养：将1L液体培养基灌装到3L三角瓶中，用透气封口膜封口后于高压灭菌锅中121℃、0.1Mpa灭菌20min；冷却后按照每1000mL液体培养基接种上述步骤（1）培养后的种子平板带菌培养基块40～80cm2的比例接种，封口，置于恒温培养箱中培养，自然光照，培养时间为21～24天，得到培养物。
其中，所用到的培养基如下：
种子固体培养基为：每500mL马铃薯煮汁中加入20.0g蔗糖、20.0g海盐和15.0g琼脂，自然pH值；
液体培养基为：每500mL马铃薯煮汁中加入20.0g蔗糖和20.0g海盐，自然pH值；
其中，马铃薯煮汁：取新鲜马铃薯去皮切成1cm3大小块状，每200g马铃薯块加蒸馏水500mL煮沸20min，双层脱脂纱布过滤，并以蒸馏水定容至500mL。
上述海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005的培养物在制备抗老年痴呆药物中的应用，以及在制备抗氧化药物和/或抑制乙酰胆碱酯酶活性的药物中的应用，也都在本专利技术的保护范围之内。
另外，经过大量的研究和测试，本专利技术的海洋真菌菌株哈茨木霉（Trichodermaharzianum）DLEN2008005可以利用常规的静置方法培养，培养基中可含有用于微生物培养的碳源、氮源及其它营养源，对光照无严格限制，以适宜于该菌株生长为准。
以制备抗氧化和抑制乙酰胆碱酯酶活性产物为目的时，发酵培养应选择使培养物的活性提取物的收率最高的条件为好。由以上所得的培养物出发，通过一些适当的方法就能提取其中的活性组分，这些方法是常用于提取代谢物的方法，例如可利用活性提取物与其它杂质在溶解度、离子结合力、吸附亲和力及分子量等方面的差别进行提取，这些方法可以单独使用，也可以适当配合或反复使用。
其中，以如下培养基、培养方法和提取方法来培养海洋真菌菌株哈茨木霉DLEN2008005产生活性产物最佳：
（1）培养基：
种子固体培养基为：蔗糖20.0g，马铃薯煮汁500mL，海盐20.0g，琼脂15.0g，自然pH值。
液体培养基为：蔗糖20.0g，马铃薯煮汁500mL，海盐20.0g，自然pH值。
其中，马铃薯煮汁：取新鲜马铃薯去皮切成1cm3大小块状，每200g马铃薯块加蒸馏水500mL煮沸20min，双层脱脂纱布过滤，并以蒸馏水定容至500mL。
（2）培养和提取方法：
A．种子培养：将菌种从斜面上接种到无菌的种子固体培养基平板上，将培养皿平板置于恒温培养箱中28℃下倒置培养，培养时间为4～5天；
B．扩大培养：将1L液体培养基灌装到3L三角瓶中，用透气封口膜封口后于高压灭菌锅中121℃、0.1Mpa灭菌20min；冷却后按照每1000mL液体培养基接种上述步骤A培养后的种子平板带菌培养基块40～80cm2的比例接种，封口，置于恒温培养箱中培养，自然光照，培养时间为20～25天，得到发酵液；
C．提取：培养结束后得到的发酵液，用500mL乙酸乙酯过夜杀菌，然后超声处理30min，加入硅藻土抽滤，滤液用等体积乙酸乙酯萃取3次，得到乙酸乙酯提取物；滤饼用200mL甲醇浸泡12～24小时后，超声30mi本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株海洋真菌哈茨木霉（Trichoderma harzianum）DLEN2008005，其特征在于，于2016年1月29日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.12105；保藏地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所。
【技术特征摘要】
1.一株海洋真菌哈茨木霉（Trichodermaharzianum）DLEN2008005，其特征在于，于2016年1月29日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNo.12105；保藏地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所。
2.根据权利要求1所述海洋真菌哈茨木霉（Trichodermaharzianum）DLEN2008005，其特征在于，该菌株的ITS1-5.8S-ITS2rDNA序列如SEQIDNO.1所示。
3.根据权利要求1所述海洋真菌哈茨木霉（Trichodermaharzianum）DLEN2008005，其特征在于，该菌株具有下述性质：接种到海水马铃薯蔗糖培养基平板上，28℃培养，菌落开始为白絮状，圆形，向四周扩展，后从菌落中央向边缘产生灰绿色孢子，菌落边缘颜色略浅，整个菌落呈松散絮状；显微镜下菌丝纤细无色，具分隔，多分枝；分生孢子梗从菌丝的侧枝上生出，对生或互生，一般有2～3次分枝，着生分生孢子的小梗瓶形或锥形；分生孢子多为球形，孢壁具小疣突，蓝绿色；该菌株最佳生长温度范围26～30℃，最佳生长pH为6.0～7.0，最佳生长盐浓度范围为2.0%～5.0%，可利用葡萄糖、蔗糖、乳糖；该菌株在海水马铃薯蔗糖液体培养基中静置发酵可产生抗氧化和乙酰胆碱酯酶抑制剂活性物质。
4.权利要求1所述海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005在制备抗老年痴呆药物中的应用。
5.权利要求1所述海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005在制备抗氧化药物和/或抑制乙酰胆碱酯酶活性的药物中的应用。
6.权利要求1所述海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005的培养物，其特征在于，包含菌体和菌体发酵培养产物。
7.根据权利要求6所述海洋真菌哈茨木霉DLEN2008005的培养物，其特征在于，所述培养物...
【专利技术属性】
技术研发人员：张翼，鲍海燕，聂影影，许茂鑫，冯妍，刘敬珊，黎燕媚，黎钊坪，宋采，胡雪琼，
申请(专利权)人：广东海洋大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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