脱酰胺基麦胶蛋白多肽重组抗原、重组抗原表达基因、重组表达载体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种脱酰胺基麦胶蛋白多肽重组抗原、重组抗原表达基因、重组表达载体及其制备方法和应用。脱酰胺基麦胶蛋白多肽重组抗原包括DGP‑1肽段、白介素15蛋白和DGP‑2肽段，所述DGP‑1肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述DGP‑2肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术提供的脱酰胺基麦胶蛋白多肽重组抗原用于乳糜泄检测时灵敏度好、特异性高且制备成本低，可以测定血清中的IgG‑DGP抗体，特别是能够用于IgA缺陷患者以及婴幼儿人群中潜在乳糜泄患者的检测。

Recombinant antigen, recombinant antigen expression gene, recombinant expression vector of deamidated gliadin polypeptide and its preparation method and Application

【技术实现步骤摘要】
脱酰胺基麦胶蛋白多肽重组抗原、重组抗原表达基因、重组表达载体及其制备方法和应用
本专利技术涉及乳糜泻诊断
，特别是涉及一种脱酰胺基麦胶蛋白多肽重组抗原、重组抗原表达基因、重组表达载体及其制备方法和应用。
技术介绍
乳糜泻(celiacdisease,CD)，又称特发性脂肪泻、成人乳糜泻、非热带口炎性腹泻或麦胶性肠病，是一种遗传易感个体因摄入含麸质蛋白的谷物(小麦、大麦和祼麦)及其制品而诱发的慢性自身免疫性肠病。乳糜泻遗传相关基因研究表明，该疾病与特殊的人类白细胞抗原II型基因密切相关，如定位于染色体6p21上的HLA-DQ2和HLA-DQ8基因。乳糜泄的诊断方法有基因检测、肠道活检以及血清学检测。基因检测主要用于筛查携带有HLA-DQ2和HLA-DQ8基因型的乳糜泄高危人群，然而受环境影响，只有3％携带这两种基因型的人群会发展成乳糜泄。肠道活检是诊断乳糜泄的黄金标准，世界胃肠病学组织推荐的乳糜泄诊断标准是小肠活检阳性，同时血清学检测阳性可确诊。血清学检测以IgA(免疫球蛋白A)为基础，有已经过时的IgA抗麦胶蛋白抗体(AGA)，以及随后出现的IgA抗肌内膜抗体(anti-EMA)和IgA抗组织转谷氨酰胺酶抗体(anti-tTG)，然而对于IgA缺陷的患者，可能出现血清anti-tTG和anti-EMA假阴性表现。IgG-DGP由于其高敏感性和特异性，可作为选择性IgA缺陷患者最精确的检测手段。特别是在免疫系统尚未发育成熟的婴儿体内，DGP抗体能够比anti-tTG及anti-EMA更早的诊断乳糜泄，高浓度DGP抗体与肠道损伤的严重程度呈正相关。专利技术内容基于此，有必要提供一种灵敏度好、特异性高的可用于乳糜泄诊断的脱酰胺基麦胶蛋白多肽重组抗原。一种脱酰胺基麦胶蛋白多肽重组抗原，包括白介素15蛋白和分别连接于所述白介素15蛋白两端的DGP-1肽段和DGP-2肽段，所述DGP-1肽段的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，所述DGP-2肽段的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。在其中一个实施例中，还包括六聚组氨酸标签和Flag标签，所述白介素15蛋白和分别连接于所述白介素15蛋白两端的DGP-1肽段和DGP-2肽段构成融合蛋白，所述六聚组氨酸标签和所述Flag标签分别连接于所述融合蛋白的两端。在其中一个实施例中，所述六聚组氨酸标签、DGP-1肽段、白介素15蛋白、DGP-2肽段和Flag标签依次通过连接肽连接。本专利技术还提供了一种重组抗原表达基因，包括与上述脱酰胺基麦胶蛋白多肽重组抗原的氨基酸序列对应的核苷酸序列。本专利技术还提供了一种重组表达载体，包括上述重组抗原表达基因和表达载体。在其中一个实施例中，所述表达载体为pET-21a(+)、pET-28a(+)或pET-30a(+)。本专利技术还提供了上述脱酰胺基麦胶蛋白多肽重组抗原、上述重组抗原表达基因或上述重组表达载体在制备用于诊断乳糜泻的产品中的应用。本专利技术还提供了一种乳糜泻诊断试剂盒，包括上述脱酰胺基麦胶蛋白多肽重组抗原。在其中一个实施例中，还包括磁微球，所述脱酰胺基麦胶蛋白多肽重组抗原与所述磁微球偶联，所述磁微球带有氨基基团。本专利技术还提供了一种上述脱酰胺基麦胶蛋白多肽重组抗原的制备方法，包括以下步骤：获得与所述脱酰胺基麦胶蛋白多肽重组抗原的氨基酸序列对应的核苷酸序列，并进行双酶切和连接以插入到表达载体中得到重组表达载体，将所述重组表达载体转入宿主进行表达，然后将表达产物分离、纯化，得到所述脱酰胺基麦胶蛋白多肽重组抗原。本专利技术的脱酰胺基麦胶蛋白多肽重组抗原选择两个DGP优势表位肽段，即DGP-1肽段和DGP-2肽段，有利于提高检测灵敏度和特异性。进一步地，将DGP-1肽段和DGP-2肽段分别连接在白介素15蛋白的两端，一方面白介素15蛋白属于人体内源性蛋白，不具有免疫原性，从而可有效降低背景噪音，避免出现假阳性的问题；另一方面，白介素15蛋白本身就与乳糜泻的免疫系统反应流程相关，当麸质蛋白降解生成的一些大的肽段透过上皮屏障，进入粘膜固有层，肽段中的谷氨酰胺可被组织转谷氨酰胺酶脱酰胺生成带负电荷的谷氨酸，成为脱酰胺基麦胶蛋白多肽，从而与抗原递呈细胞表面的HLA-DQ2和HLA-DQ8亲和力增加，使肽段更易被抗原递呈细胞识别，激活的反应性CD4+T细胞释放细胞因子IL-15，因此乳糜泻患者血清中的IL-15浓度更高，将IL-15与DGP-1肽段和DGP-2肽段融合更有利于提高检测的灵敏度和特异性。附图说明图1为实施例1中对脱酰胺基麦胶蛋白定标品进行检测得到的标准曲线。具体实施方式为了便于理解本专利技术，下面将对本专利技术进行更全面的描述，并给出了本专利技术的较佳实施例。但是，本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本专利技术的公开内容的理解更加透彻全面。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本专利技术。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。本专利技术一实施例的脱酰胺基麦胶蛋白多肽重组抗原，包括白介素15蛋白和分别连接于白介素15蛋白两端的DGP-1肽段和DGP-2肽段，DGP-1肽段的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，DGP-2肽段的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，白介素15蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。可以理解，DGP-1肽段和DGP-2肽段的位置可以相互调换，即DGP-1肽段可以连接于白介素15蛋白的N端或C端。脱酰胺基麦胶蛋白多肽(DGP)是谷类食物中的醇溶蛋白因富含脯氨酸而在经过酶消化后，未完全水解的原始多肽片段被吸收并经过tTG(组织转谷氨酰胺酶)修饰的多肽，多肽上某些位点的谷氨酰胺残基脱酰胺基变成谷氨酸残基。DGP经过刺激免疫系统，产生了抗DGP的自身抗体。DGP的原始多肽可以来源于α/β型麦胶蛋白，也可以来源于γ型或者ω型麦胶蛋白。IgG-DGP由于其高敏感性和特异性，可作为选择性IgA缺陷患者最精确的检测手段，特别是在免疫系统尚未发育成熟的婴儿体内，DGP抗体能够比anti-tTG及anti-EMA更早的诊断乳糜泄，高浓度DGP抗体与肠道损伤的严重程度呈正相关。目前，多肽主要依靠化学法和重组表达法合成。化学法即多肽固相合成法(SPPS)，是一种通过化学反应合成预设氨基酸序列的多肽的方法。首先将一个氨基被封闭基团保护的氨基酸共价连接在固相载体氯甲基聚苯乙烯树脂上。再利用三氟乙酸脱掉氨基的保护基，然后氨基被保护的第二个氨基酸的羧基通过N,Nˊ-二环己基碳二亚胺(DCC)活化，再与已接在固相载体的第一个氨基酸的氨基反应形成肽键，以此重复操作，最后脱去保护基团，水解肽链与固相载体之间的酯键，就能在固相载体上生成一个预设的多肽。但是，化学合成出来的多肽因为疏水性强而造成稳定性低，而且丧失多肽的天然构象，导致用于检测抗体时灵敏度低，成本也较高。重组表达法则是将目标肽段，与一些常见的标签如谷胱甘肽S转移酶(Glutathione-Stransferase,GST)、麦芽糖结合蛋白(Maltose-bindingprote本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种脱酰胺基麦胶蛋白多肽重组抗原，其特征在于，包括白介素15蛋白和分别连接于所述白介素15蛋白两端的DGP‑1肽段和DGP‑2肽段，所述DGP‑1肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述DGP‑2肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

【技术特征摘要】
1.一种脱酰胺基麦胶蛋白多肽重组抗原，其特征在于，包括白介素15蛋白和分别连接于所述白介素15蛋白两端的DGP-1肽段和DGP-2肽段，所述DGP-1肽段的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，所述DGP-2肽段的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。2.根据权利要求1所述的脱酰胺基麦胶蛋白多肽重组抗原，其特征在于，还包括六聚组氨酸标签和Flag标签，所述白介素15蛋白和分别连接于所述白介素15蛋白两端的DGP-1肽段和DGP-2肽段构成融合蛋白，所述六聚组氨酸标签和所述Flag标签分别连接于所述融合蛋白的两端。3.根据权利要求2所述的脱酰胺基麦胶蛋白多肽重组抗原，其特征在于，所述六聚组氨酸标签、DGP-1肽段、白介素15蛋白、DGP-2肽段和Flag标签依次通过连接肽连接。4.一种重组抗原表达基因，其特征在于，包括与权利要求1～3任一项所述的脱酰胺基麦胶蛋白多肽重组抗原的氨基酸序列对应的核苷酸序列。5.一种重组表达载体，其特征在于，包括权利要求4所述的重组抗原表达基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑亮，罗春雷，钱纯亘，胡鹍辉，
申请(专利权)人：深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44