检测单基因突变的CRISPR高通量生物芯片制造技术

本发明专利技术公开了一种检测单基因突变的CRISPR高通量生物芯片，利用CRISPR‑Cas12a蛋白特异性切割双链DNA后所产生的对单链DNA切割的非特异性，通过单链荧光探针被Cas12a蛋白非特异性切割之后所产生荧光强弱变化，构建检测单基因突变的CRISPR高通量生物芯片。本发明专利技术利用疏水蛋白对芯片基底进行修饰，经过疏水蛋白修饰的芯片基底与普通基底相比，不仅使亲水蛋白Cas12a在芯片表面均匀铺展，还避免了蛋白和crRNA的浪费，保证目的基因在低浓度下仍有较好的检测结果，并实现了目的基因的1个拷贝的检测，与普通单基因疾病检测相比具有效率高、成本低、周期短、特异性强的特点，且检测材料稳定、操作难度低，结果直观可靠，十分有望投入实际应用。

High-throughput CRISPRs biochip for detection of single gene mutations

【技术实现步骤摘要】
检测单基因突变的CRISPR高通量生物芯片
本专利技术属于生物
，具体地说，本专利技术涉及一种检测单基因突变的CRISPR高通量生物芯片及构建方法。
技术介绍
单基因病(monogenicdisease)主要指由一对等位基因突变导致的疾病，分为由显性基因和隐性基因突变所致的两种情况。在临床诊断中，有许多的疾病由单基因的突变而引起。由于单基因疾病有其独一无二的特征基因突变位点，因此可以开发出针对特定单基因疾病的核酸分子检测。核酸诊断(NADsnucleicaciddiagnostics)是用分子生物学的理论和技术，通过直接探查不同物种特定核酸的存在状态，从核酸自身结构、复制、转录或翻译过程分析核酸的功能，从而有针对性的做出诊断的方法。与此相类似的还有单核苷酸多态性(SNPs，singlenucleotidepolymorphisms)检测，SNPs广泛存在于人类基因组中，其发生频率约为1％或更高，SNPs检测技术的发展对于基因样品检测尤为重要。但上述的单基因突变疾病检测不仅存在非人为操作的技术问题，而且每次只能检测少数几种甚至一种的单基因疾病，加上检测技术成本过高，这些技术在单基因突变疾病检测上并没有被广泛应用。由于DNA分子稳定性较高，当前的NADs方法大多是对DNA分子进行检测，也有部分方法针对RNA分子进行检测。进行核酸分子检测的步骤大致为两步：第一步是目标DNA的扩增，第二步是目标DNA的检测。SNP中核苷酸的变化有两种形式：一种是转换，另一种是颠换。随着生物技术的不断发展，出现了一类高通量、自动化程度较高的SNP检测方法，如直接测序、DNA芯片等。目前，美国昂菲公司利用分子杂交和原位荧光检测，已经制成SNPs检测的高通量生物芯片，但是芯片设计成本高，而且有些SNP不能被检测。生物芯片是根据生物分子间特异相互作用的原理，将生化分析过程集成于芯片表面，从而实现对DNA、RNA、多肽、蛋白质以及其他生物成分的高通量快速检测。可作为各种检测方法的操作平台，即能够同时进行大量不同反应条件的实验分析并输出数据，实现对不同靶标的同时、高速的检测。疏水蛋白是一种高等丝状真菌在特定时期产生的一类具有特殊理化性质的小分子量(12KD左右)蛋白质，其蛋白结构比较特殊，既含有亲水结构，也含有疏水结构，整体结构上表现为双亲性。疏水蛋白的双亲性使其像表面活性剂一样，主要功能为能够自主装在任何亲水/疏水表面形成一层两亲性的膜以改变表面性质。疏水蛋白是已知的表面活性最高的蛋白质之一，具有耐高温、耐酸碱等特性，可试用于调整实际操作中蛋白分子排列的结构，以实现更高的反应效率，在实际生产中具有很高的理论价值和应用价值。CRISPR-Cas12a蛋白是一种RNA指导的酶，作为细菌适应性免疫系统的组分，其拥有T富集的前间区序列邻近基序(PAM)，能催化他们自己的引导RNA(crRNA)成熟并产生一个PAM末端不规则的双链DNA断点。Cas12a蛋白在特异性切割后，还能不加区分的非特异性切割DNA单链，应用这个独特性质，我们便可以通过荧光探针检测系统是否完成切割功能。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种检测单基因突变的CRISPR高通量生物芯片，克服现有技术生物芯片的不足如低通量、高成本、技术缺陷等问题。本专利技术的技术方案为：检测单基因突变的CRISPR高通量生物芯片，构建方法包括如下步骤：(1)化学合成含有Cas12a蛋白序列的大肠杆菌表达载体、含有PAM(PAM指前间区序列邻近基序,是Cas12a行使切割功能所必须的识别序列,FnCas12a的PAM序列为TTN)的特异性底物、含有PAM序列的PCR上游引物、下游引物、荧光探针，以及对应于FnCas12a和相应单基因突变疾病的crRNA(crRNA，即向导RNA，是指引导FnCas12a蛋白特异性结合靶标DNA的RNA，crRNA长约43bp)，确定Cas12a蛋白在大肠杆菌重组质粒中的表达；(2)Cas12a和crRNA的复合物对特异性底物(包括合成的质粒和通过设计含有PAM的上游引物PCR扩增得到的长140bp左右的片段)——双链DNA进行特异性切割的体系的构建,包括对双链DNA切割实验比例的优化、对PCR扩增片段的切割；(3)Cas12a和crRNA的复合物对单链DNA(包括合成的单链DNA和荧光探针)进行非特异性切割的体系的构建,包括对普通单链DNA的切割、对荧光探针单链DNA的切割；(4)将芯片基底进行疏水蛋白修饰；(5)构建高通量芯片基底，包括疏水蛋白对FnCas12a-crRNA复合物的固定、复合物对特异性底物的特异性切割和对荧光探针的非特异性切割。所述步骤(4)疏水蛋白指一些双亲性蛋白，可在两相界面处通过自我装配形成纳米级厚度的两性蛋白膜。所述步骤(4)疏水蛋白指HGFⅠ、HFBⅠ。所述Cas12a蛋白优选为FnCas12a蛋白。检测单基因突变的CRISPR高通量生物芯片的构建方法，包括如下步骤：(1)化学合成含有Cas12a蛋白序列的大肠杆菌表达载体、特异性底物、含有PAM序列的PCR上游引物、下游引物、荧光探针，以及对应于Cas12a和相应单基因突变疾病的crRNA，确定FnCas12a蛋白在大肠杆菌重组质粒中的表达；(2)Cas12a和crRNA的复合物对特异性底物——双链DNA进行特异性切割的体系的构建,包括对双链DNA切割实验比例的优化、对PCR扩增片段的切割；(3)Cas12a和crRNA的复合物对单链DNA进行非特异性切割的体系的构建,包括对普通单链DNA的切割、对荧光探针单链DNA的切割；(4)将芯片基底进行疏水蛋白修饰；(5)构建高通量芯片基底，包括疏水蛋白对Cas12a-crRNA复合物的固定、复合物对特异性底物的特异性切割和对荧光探针的非特异性切割。所述步骤(4)疏水蛋白指一些双亲性蛋白，可在两相界面处通过自我装配形成纳米级厚度的两性蛋白膜。所述步骤(4)疏水蛋白指HGFⅠ、HFBⅠ。所述Cas12a蛋白优选为FnCas12a蛋白。检测单基因突变的CRISPR高通量生物芯片的应用。本专利技术有益效果：本专利技术利用疏水蛋白对芯片基底进行修饰，经过疏水蛋白修饰的芯片基底与普通基底相比，不仅使亲水蛋白Cas12a在芯片表面均匀铺展，还避免了蛋白和crRNA的浪费，保证目的基因在低浓度下仍有较好的检测结果，并实现了目的基因的1个拷贝的检测，与普通单基因疾病检测相比具有效率高、成本低、周期短、特异性强的特点，且检测材料稳定、操作难度低，结果直观可靠，十分有望投入实际应用。附图说明图1显示了2种不同来源的Cas12a——FnCas12a、LbCas12a的WesternBlot图；图2显示了特异性底物的琼脂糖凝胶电泳图；其中：图2A显示了两种质粒pDsRed-Monomer-N1、pAcGFP1-N1的琼脂糖凝胶电泳图；图2B显示了转录激活因子GATA4表达载体的琼脂糖凝胶电泳图；图2C显示了质粒pAcGFP1-N1的PCR片段的琼脂糖凝胶电泳图；图3显示了FnCas12a切割特异性双链DNA的特性；其中：图3A为FnCas12a特异性切割质粒的蛋白质梯度电泳结果图；图3B为FnCas12a特异性切割质粒的质粒梯度电泳结果图；图3C为FnCas12a特异本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.检测单基因突变的CRISPR高通量生物芯片，其特征在于，构建方法包括如下步骤：(1)化学合成含有Cas12a蛋白序列的大肠杆菌表达载体、特异性底物、含有PAM序列的PCR上游引物、下游引物、荧光探针，以及对应于Cas12a和相应单基因突变疾病的crRNA，确定FnCas12a蛋白在大肠杆菌重组质粒中的表达；(2)Cas12a和crRNA的复合物对特异性底物——双链DNA进行特异性切割的体系的构建,包括对双链DNA切割实验比例的优化、对PCR扩增片段的切割；(3)Cas12a和crRNA的复合物对单链DNA进行非特异性切割的体系的构建,包括对普通单链DNA的切割、对荧光探针单链DNA的切割；(4)将芯片基底进行疏水蛋白修饰；(5)构建高通量芯片基底，包括疏水蛋白对Cas12a‑crRNA复合物的固定、复合物对特异性底物的特异性切割和对荧光探针的非特异性切割。

【技术特征摘要】
1.检测单基因突变的CRISPR高通量生物芯片，其特征在于，构建方法包括如下步骤：(1)化学合成含有Cas12a蛋白序列的大肠杆菌表达载体、特异性底物、含有PAM序列的PCR上游引物、下游引物、荧光探针，以及对应于Cas12a和相应单基因突变疾病的crRNA，确定FnCas12a蛋白在大肠杆菌重组质粒中的表达；(2)Cas12a和crRNA的复合物对特异性底物——双链DNA进行特异性切割的体系的构建,包括对双链DNA切割实验比例的优化、对PCR扩增片段的切割；(3)Cas12a和crRNA的复合物对单链DNA进行非特异性切割的体系的构建,包括对普通单链DNA的切割、对荧光探针单链DNA的切割；(4)将芯片基底进行疏水蛋白修饰；(5)构建高通量芯片基底，包括疏水蛋白对Cas12a-crRNA复合物的固定、复合物对特异性底物的特异性切割和对荧光探针的非特异性切割。2.根据权利要求1所述检测单基因突变的CRISPR高通量生物芯片，其特征在于，所述步骤(4)疏水蛋白指一些双亲性蛋白，可在两相界面处通过自我装配形成纳米级厚度的两性蛋白膜。3.根据权利要求2所述检测单基因突变的CRISPR高通量生物芯片，其特征在于，所述步骤(4)疏水蛋白指HGFⅠ、HFBⅠ。4.根据权利要求1所述检测单基因突变的CRISPR高通量生物芯片，其特征在于，所述Cas12a蛋白优选为FnCas12a蛋白。5.检测单基因突变的CRISPR高通量生物芯片的构...

【专利技术属性】
技术研发人员：王泽方，高雪纯，陈林鹏，杨海涛，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津,12