一种可控永生化的逆转录病毒载体和人脐带间充质干细胞及其构建方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及了一种可控永生化的逆转录病毒载体和人脐带间充质干细胞及其构建方法。所述的构建方法，借助Tet‑on 3G系统构建含永生化因子的可控永生化逆转录病毒载体，包装逆转录病毒感染脐带间充质干细胞，通过添加诱导物诱导永生化因子基因的表达，将其转化为具有高增殖能力的永生化细胞；当需要将细胞用于正常生理或疾病治疗时，撤销诱导物，永生化因子基因处于转录关闭状态，细胞回复原代脐带间充质干细胞特性，在基因功能研究或是疾病治疗中都具有十分重要的意义。

A Controllable Immortalized Retroviral Vector and Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells and Its Construction Method

【技术实现步骤摘要】
一种可控永生化的逆转录病毒载体和人脐带间充质干细胞及其构建方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种可控永生化的逆转录病毒载体和人脐带间充质干细胞及其构建方法。
技术介绍
人脐带间充质干细胞(humanumbilicalcordmesenchymalstemcells，hUMSCs)是一类来源于中胚层具有多向分化潜能的基质细胞，免疫原性低且具有免疫调控功能，在基因治疗和细胞替代治疗、免疫性疾病方面有着广泛的临床应用前景。然而，hUMSCs与机体其他正常细胞一样，经过有限次的细胞传代后，出现细胞停止增殖，发生衰老和死亡，即细胞老化现象(cellsenescence)。研究显示，hUMSCs在体外培养约10-30代左右出现细胞老化，这就阻碍了hUMSCs在临床应用和机制方面的研究。若可以将hUMSCs永生化，使其能够避免细胞培养过程中出现老化、干性消失，保持多潜能分化状态，不仅能为细胞生物学的研究提供稳定性状，在基因治疗、细胞治疗等研究方面也具有潜在的应用价值。细胞永生化是指细胞自发或受体外因素影响能克服增殖危机，具有无限增殖的能力。1998年，Bodnar和Ouellette等将人端粒酶逆转录酶基因(humantelomerasereversetranscriptase，TERT)转染到原代视网膜色素上皮细胞和成纤维细胞中，细胞寿命至少延长了20倍。2003年，Cui将TERT基因转染到绵羊成纤维细胞中，携带TERT基因的成纤维细胞能够连续培养500天以上，未携带TERT基因组只能连续培养200天左右。因此，通过转入外源性的永生化基因TERT来获得细胞永生化状态。目前也有通过将重组到慢病毒载体的TERT基因转染hUMSCs使其延长寿命的方法，但是转化的细胞会在细胞表型或代谢方式上和原代分离的细胞有所差异。另外，将病毒转化的细胞连续不可控的表达永生化因子TERT的细胞模型替代原代细胞进行研究存在潜在的风险性，会使它在细胞治疗、基因治疗等临床应用中受到限制。四环素诱导表达系统由强启动子、四环素反应元件和四环素类小分子诱导剂构成，其中Tet-On系统的调节蛋白为反义四环素转录激活子，在无诱导物的情况下能持续保持外源基因转录关闭的状态，当存在诱导物时，外源基因转录被激活。Tet-On系统中，不存在诱导物时，反式转录活化因子(rtTA)仍会少量的结合TRE，造成一定的背景表达。在基因治疗领域，常见的外源基因递送载体有非整合型载体和逆转录病毒载体，但是非整合型载体的转染效率取决于细胞种类及转染试剂，并且只能在细胞核外暂时表达，导致永生化效率偏低。携带永生化因子的逆转录病毒转化的脐带间充质干细胞，能够持续不可控的表达永生化因子TERT，使其在临床应用中有潜在的风险性，会使它在细胞治疗、基因治疗中受到限制。另外，Tet-On3G系统只有在添加诱导物的情况下，才能诱导表达永生化因子TERT，但是不能将外源基因整合到细胞基因组。可见，现有技术亟待改进。
技术实现思路
鉴于此，有必要针对上述问题提供一种可控永生化的逆转录病毒载体和人脐带间充质干细胞及其构建方法，以克服现有永生化脐带间充质干细胞构建的缺陷，能较好的解决永生化因子TERT连续不可控的表达带来的不安全性。本专利技术通过以下技术方案实现的：一种可控永生化脐带间充质干细胞的构建方法，操作包括：(S1)借助Tet-on3G系统构建含永生化因子TERT的可控永生化逆转录病毒载体；(S2)包装步骤(S1)的逆转录病毒载体，感染脐带间充质干细胞；(S3)通过添加诱导物诱导永生化因子TERT表达，将其转化为具有高增殖能力的永生化细胞。进一步的，所述可控永生化脐带间充质干细胞的构建方法，其步骤(S1)的具体操作包括：S11、重组质粒pUC19-PTRE3G的构建：以携带有PTRE3G启动子序列的质粒为模板，PCR扩增PTRE3G启动子序列插入到pUC19载体质粒，PTRE3G启动子序列如序列表中SEQIDNO：1所示；S12：重组质粒pUC19-PTRE3G-TERT的构建：以携带有TERT基因的质粒为模板，PCR扩增TERT基因插入到重组质粒pUC19-PTRE3G的PTRE3G启动子序列下游，TERT基因序列如序列表中SEQIDNO：2所示；S13、重组质粒pCMV-PuroR-T2A-Tet3G的构建：以携带有PuroR基因、T2A基因的质粒为模板，PCR扩增PuroR基因和T2A基因插入到pCMV-TetON3G载体质粒，PuroR和T2A基因序列分别如序列表中SEQIDNO：4、SEQIDNO：5所示；S14、重组质粒pCLXSN-PTRE3G-TERT的构建：以步骤S12中获得的重组质粒为模板，PCR扩增PTRE3G-TERT基因插入到pCLXSN载体质粒。S15、重组质粒pCLXSN-TetON3G-TERT的构建：以步骤S13中获得的重组质粒为模板，PCR扩增CMV-PuroR-T2A-TetON3G-SV40poly(A)signal基因定向插入到pCLXSN-PTRE3G-TERT载体质粒，重组构建的载体质粒还携带了CMV基因(SEQIDNO：3)、T2A基因序列(SEQIDNO：5)、TetON3G基因(SEQIDNO：6)、SV40poly(A)signal(SEQIDNO：7)基因和KanR元件(SEQIDN0:8)；编码Tet-on3G基因以及PTRE3G基因的意义用于永生化因子TERT在脐带间充质细胞中，通过添加诱导物实现可控表达。编码PuroR基因的意义在于，筛选出整合了外源基因的阳性克隆细胞。进一步的，所述可控永生化脐带间充质干细胞的构建方法，其步骤(S2)的具体操作包括：S21：将步骤S1中的重组逆转录病毒载体与包装质粒共转染293T细胞进行逆转录病毒包装，浓缩病毒液后进行病毒滴度检测；S22：将携带TERT基因的逆转录病毒感染原代脐带间充质干细胞，嘌呤霉素筛选得到稳定的细胞系。进一步的，所述嘌呤霉素浓度为0.2μg/mL。进一步的，所述步骤(S3)中通过添加诱导物调控TERT基因的表达，具体包括：当培养基中添加有诱导物时，诱导表达TERT；当需要将细胞用于正常生理或疾病治疗时，撤销诱导物，TERT基因处于转录关闭状态，细胞回复原代脐带间充质干细胞特性。通过对诱导物诱导的逆转录病毒转化的细胞进行蛋白表达、诱导分化能力等特性分析，结果显示，具有典型的脐带间充质干细胞特性。进一步的，所述诱导物可选强力霉素或地美环素或米诺霉素或金霉素或土霉素或四环素。进一步的，所述诱导物的诱导浓度为0.2μg/mL。一种可控永生化逆转录病毒载体，携带有PTRE3G启动子(SEQIDNO：1)、TERT基因(SEQIDNO：2)、PuroR基因(SEQIDNO：4)、T2A基因(SEQIDNO：5)、CMV启动子(SEQIDNO：3)、TetON3G基因(SEQIDNO：6)、SV40poly(A)signal基因(SEQIDNO：7)、KanR元件(SEQIDNO：8)。本专利技术有益效果：本专利技术技术方案为了生物安全的考量，在构建的逆转录病毒载体中引入Tet-on3G系统，构建一种可控永生化的脐带间充质干细胞，对永生化因子TERT实施精确的调控，建立可控永生化hU本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种可控永生化脐带间充质干细胞的构建方法，其特征在于，操作步骤包括：(S1)构建含永生化因子的可控永生化逆转录病毒载体；(S2)包装步骤(S1)的逆转录病毒载体，感染脐带间充质干细胞；(S3)通过添加诱导物调控TERT基因的表达，将其转化为具有高增殖能力的永生化细胞。

【技术特征摘要】
1.一种可控永生化脐带间充质干细胞的构建方法，其特征在于，操作步骤包括：(S1)构建含永生化因子的可控永生化逆转录病毒载体；(S2)包装步骤(S1)的逆转录病毒载体，感染脐带间充质干细胞；(S3)通过添加诱导物调控TERT基因的表达，将其转化为具有高增殖能力的永生化细胞。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法，其步骤(S1)的具体操作包括：S11：以携带有PTRE3G启动子序列的质粒为模板，PCR扩增PTRE3G启动子序列插入到pUC19载体质粒，PTRE3G启动子序列如序列表中SEQIDNO：1所示；S12：以携带有TERT基因的质粒为模板，PCR扩增TERT基因插入到pUC19-PTRE3G载体质粒的PTRE3G启动子序列下游，TERT基因序列如序列表中SEQIDNO：2所示；S13：以携带有PuroR基因、T2A基因的质粒为模板，PCR扩增PuroR基因和T2A基因插入到pCMV-TetON3G载体质粒，PuroR和T2A基因序列分别如序列表中SEQIDNO：4、SEQIDNO：5所示；S14：以步骤S12中获得的重组质粒pUC19-PTRE3G-TERT为模板，PCR扩增PTRE3G-TERT基因插入到pCLXSN载体质粒；S15：以步骤S13中获得的重组质粒为模板，PCR扩增CMV-PuroR-T2A-TetON3G-SV40poly(A)signal基因定向插入到pCLXSN-PTRE3G-TERT载体质粒，构建的重组质粒携带了CMV基因、T2A基因序列、TetON3G基因SV40poly(A)signal基因和KanR序列，分别如序列表中S...

【专利技术属性】
技术研发人员：张娇，邹翠云，张蓓，江福能，钟惟德，朱建国，
申请(专利权)人：广州辉园苑医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44